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形質膜結合性ホスファチジン酸ホスフォターゼの構造と機能の解析

质膜结合磷脂酸磷酸酶的结构和功能分析

基本信息

批准号：
09770084
负责人：
甲斐正広
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770084/
关键词：
ホスファチジン酸ホスファターゼホスファチジン酸

项目摘要

ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP2)の生理的機能を明らかにするために、前年度から引き続いて酵素の活性ドメインに関する研究を行った。PAP2bをtransientに発現した293細胞を準備して、その培地に^<32>Pでラベルしたリゾホスファチジン酸を加えた。一定時間後培地中に遊離された無機リン酸量はPAP2過剰発現細胞の方がコントロール細胞より多かった(約2倍)。細胞内の無機リン酸量には有意の差が見られず、したがってPAP2bは細胞外に触媒部位を持つecto-PAPであることが示唆された。その一方、無細胞抽出液を用いてin vitro assayを行ったときのPAP活性は、過剰発現細胞の方が10〜20倍も高い。この差が生細胞に反映されない理由を明らかにするべく、PAP2b-GFP融合タンパク質を細胞に発現させて、この局在性を蛍光顕微鏡で観察した。その結果GFPの示すシグナルは細胞内に顆粒状に存在しているものの割合の多いことがわかった。本酵素は膜タンパク質であるので、酵素が局在する膜の成分を分析するためにショ糖密度勾配遠心法で細胞分画を行った。その結果、ある程度(10〜50%)のPAP2bがいわゆるTriton X-100 insoluble membraneに存在することが示された。これはすなわち、caveolaeやmembrane raftに本酵素が局在することを示している。現在、その局在の正確な分布を調べている。

The physiological function of PAP2 was studied in the past year. PAP2b is a transient protein<32>. After a certain period of time, the amount of free inorganic acid in the culture medium was about 2 times higher than that in PAP2 cells. The amount of inorganic acid in the cell is intentionally different from that in the extracellular catalyst site. The activity of PAP in vitro assay and cell-free extract was 10 ~ 20 times higher than that in vitro assay. The reason for this is that the PAP2b-GFP fusion is detected in the cytoplasm of the cell, and the intrinsic properties of the cell are observed by microscopy. As a result, GFP was found to exist in granular form in the cell. The enzyme is used to analyze the membrane composition, sugar density, and cell analysis. The results showed that the degree of PAP2b (10 ~ 50%) was higher than that of Triton X-100 insoluble membrane. This enzyme is present in a variety of ways. Now, the bureau is in the correct distribution.