形質膜結合性ホスファチジン酸ホスフォターゼの構造と機能の解析

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ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP2)の生理的機能を明らかにするために、前年度から引き続いて酵素の活性ドメインに関する研究を行った。PAP2bをtransientに発現した293細胞を準備して、その培地に^<32>Pでラベルしたリゾホスファチジン酸を加えた。一定時間後培地中に遊離された無機リン酸量はPAP2過剰発現細胞の方がコントロール細胞より多かった(約2倍)。細胞内の無機リン酸量には有意の差が見られず、したがってPAP2bは細胞外に触媒部位を持つecto-PAPであることが示唆された。その一方、無細胞抽出液を用いてin vitro assayを行ったときのPAP活性は、過剰発現細胞の方が10〜20倍も高い。この差が生細胞に反映されない理由を明らかにするべく、PAP2b-GFP融合タンパク質を細胞に発現させて、この局在性を蛍光顕微鏡で観察した。その結果GFPの示すシグナルは細胞内に顆粒状に存在しているものの割合の多いことがわかった。本酵素は膜タンパク質であるので、酵素が局在する膜の成分を分析するためにショ糖密度勾配遠心法で細胞分画を行った。その結果、ある程度(10〜50%)のPAP2bがいわゆるTriton X-100 insoluble membraneに存在することが示された。これはすなわち、caveolaeやmembrane raftに本酵素が局在することを示している。現在、その局在の正確な分布を調べている。