ホスファチジン酸ホスファターゼの精製とcDNAクローニング

磷脂酸磷酸酶的纯化及cDNA克隆

• 批准号: 07780543
• 负责人: 甲斐 正広
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Sapporo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780543/
• 关键词: ホスファチジン酸; ジアシルグリセロール; 脂質合成

ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)を既報(Kanoh et al,1992,JBC,267)にしたがい、ブタ胸腺膜画分から2000倍に部分精製し、これを用いて更なる精製の検討を行った。様々なクロマトグラムにおける挙動から35kDaタンパク質がPAPであること考えたが、その精製法を確立するに到らなかった。そこで次に、PAP部分精製標品を電気泳動で分離、35kDaのバンドがブロットされたPVDF膜を切り出してアミノ酸部分配列の決定を試みた。その結果N末端のアミノ酸配列15残基が明らかになったので、これを基に調整したペプチド抗体を用いて以下の知見を得た。(a)この抗体は部分精製標品のPAP活性をほぼ完全に沈降した。(b)放射能標識した部分精製標品からは35kDaタンパク質だけが沈降した。(c)このタンパク質はNグリコシド型糖鎖を持っており、Nグリカナーゼ処理によってタンパク質のサイズは約29kDaに変化した。(d)ショ糖密度勾配遠心法によって胸腺細胞の細胞内小器官を分画したところ、免疫沈降するPAP活性は細胞表面膜に存在した。したがって、我々はこの35kDaタンパク質が表面膜結合性PAPであると結論した。(9th International conference on second messengers&phophoproteins,1995,Nashvilleおよび第68回日本生化学会大会,1995,仙台にて口頭発表)現在は35kDa-PAPのN末端アミノ酸配列をもとにしてcDNAクローニングを試みている。

ホ ス フ ァ チ ジ ン acid ホ ス フ ァ タ ー ゼ (PAP) を both quote (Kanoh et al., 1992, JBC, 267) に し た が い, ブ タ thymus membrane draw points か ら 2000 times に part refined し, こ れ を with い て more な る refined の 検 line for を っ た. Others 々 な ク ロ マ ト グ ラ ム に お け る 挙 dynamic か ら 35 kda タ ン パ ク qualitative が PAP で あ る こ と exam え た が, そ を の refining method established す る に to ら な か っ た. そ こ で に, PAP part refined standard product を 気 swimming で separation, 35 kda の バ ン ド が ブ ロ ッ ト さ れ た PVDF membrane を り cutting out し て ア ミ ノ acid department assign column の decided to try を み た. そ の results N terminal の ア ミ ノ acid with column 15 residues が Ming ら か に な っ た の で, こ れ を base に adjustment し た ペ プ チ を ド antibody with い て の know of these を た. (a) The <s:1> <s:1> antibody <e:1> partially refined standard product <s:1> PAP activity をほぼ completely に decreased <s:1> た. (b) Radioactive energy identification た some refined standards ら ら ら 35kDaタ パ パ radioactive material だけが deposition <s:1> た. (c) こ の タ ン パ ク qualitative は N グ リ コ シ ド type sugar lock を hold っ て お り, N グ リ カ ナ ー ゼ 処 Richard に よ っ て タ ン パ ク qualitative の サ イ ズ は about 29 kda に variations change し た. (d) シ ョ hook with much sugar density method to に よ っ て の thymus cells within the small organ を points draw し た と こ ろ, immune sink す る PAP active は cell surface membrane に exist し た. Youdaoplaceholder0 たがって, I 々 々 た た た 々 々 々 々 々 々 であると であると 35kDaタ パ パ the surface film-bound PAPであると conclusion た た. (9th International conference on second Messengers&phophoproteins, 1995, Nashville お よ び back to Japan biochemical society conference, 68, 1995, sendai に て oral 発 table) now 35 kda は - PAP の N terminal ア ミ ノ acid with column を も と に し て cDNA ク ロ ー ニ ン グ を try み て い る.

项目成果

Hideo Kanoh,et al: "Molecular propaties of engymes involved in diacylglycerol and phosphatidate metabolism" J.Lipid Med.(印刷中).

Hideo Kanoh 等人：“参与二酰甘油和磷脂酸代谢的酶的分子特性”J.Lipid Med.（出版中）。