ペプチドトランスポータ遺伝子導入安定発現系の確立に基づく薬物認識機構の分子的解明

基于导入肽转运蛋白稳定表达系统的药物识别机制的分子阐明

• 批准号: 09772024
• 负责人: 斉藤 秀之
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09772024/
• 关键词: ペプチドトランスポータ; 腸管吸収; 尿細管再吸収; β-ラクタム抗生物質; 遺伝子導入; 薬物輸送

本研究では、2種のラットH^+/駆動型ペプチドトランスポータPEPT1またはPEPT2の安定発現上皮細胞系を新たに確立することにより各々の薬物認識特性の比較解析を実地し、以下の研究成果を得た。1.ペプチドトランスポータ安定発現細胞の確立動物細胞発現ベクターに挿入したラットPEPT1またはPEPT2cDNAを構築し、遺伝子トランスフェクションによって各々のトランスポータを安定に発現する上皮細胞の単離を試みた。ノーザンプロット解析によるメッセンジャーRNAの細胞内発現、ウエスタンブロット分析によるタンパク質発現、並びにジペプチドglycylsarcosine取り込み活性を指標としてスクリーニングを行い、最終的にPEPT1またはPEPT2安定発現細胞の確立に成功した。2.PEPT安定発現細胞による薬物認識特性の比較解析ラットPEPT安定発現細胞を用い、glycylsarcosine輸送に対する競合阻害効果に基づいてPEPT1とPEPT2の薬物認識特性の比較解析を試みた。PEPT発現細胞へのglycylsarcosine取り込みに及ぼす経口用β-ラクタム抗生物質の競合阻害実験を実施し、見かけの阻害定数(Ki)によって各薬物のトランスポータに対する親和性を比較した結果、PEPT2はceftibutenとcefiximeなどのアミノ基を持たない薬物を除き、多くのβ-ラクタム抗生物質に対してPEPT1よりも高親和性であることが判明した。3.PEPT発現細胞によるペプチドトランスポータとβ-ラクタム抗生物質との相互作用解析ヒスチジン修飾試薬diethylpyrocarbonate(DEPC)の処理によって、PEPT1及びPEPT2発現細胞のglycylsarcosine取り込み活性は消失すること、DEPCのトランスポータ不活化は、過剰のジペプチドまたはアミノ基を持つセファロスポリンによって防御し得ることがわかった。一方、アミノ基を持たないセファロスポリンやベスタチンはDEPC不活化に対する防御効果を示さなかったことから、薬物のアミノ基とPEPT分子内の必須ヒスチジン残基との相互作用がトランスポータの薬物認識機序に関わっている可能性が示唆された。これらの研究成果は、ペプチド類似薬物の体内動態制御機序の解明並びにペプチドトランスポータの基質認識性を利用したドラッグデリバリーシステムの開発に有用な基礎的情報を提供するものと考えられる。

In this study, we established a new stable epithelial cell line of PEPT1 and PEPT2 with two different H^+/H +/H 1. Establishment of animal cells for stable development of cells from different species. Construction of PEPT1 and PEPT2 cDNA. Isolation of epithelial cells for stable development of cells from different species. Successful establishment of PEPT1 and PEPT2 stable development cells in the context of the intracellular development of RNA and its molecular analysis, as well as in the context of the selection of glycylsarcosine as indicators of activity. 2. Comparative analysis of chemical recognition characteristics of PEPT stability-producing cells in the context of the effects of the interaction between PEPT1 and PEPT2 on the transport of glycylsarcosine and the use of PEPT stability-producing cells. The results of comparison of the affinity of the β-class antibiotics for PEPT 2 revealed that PEPT2 had high affinity for ceftibuten and cefixime, and that PEPT2 had high affinity for β-class antibiotics. 3. Analysis of interactions between PEPT developing cells and β-antibiotics modified by diethylpyrocarbonate(DEPC). PEPT1 and PEPT2 developing cells were treated with glycylsarcosine and its activity disappeared. DEPC developing cells were not activated. The interaction of essential residues in PEPT molecules and the possibility of molecular recognition are shown. The results of these studies provide useful information for understanding the in vivo dynamic control mechanisms of these compounds and for understanding the use of these compounds as substrates for their development.

项目成果

S.Masuda: "mRNA distribution and membrane localization of the OAT-K1 organic anion transporter in rat renal tubules." FEBS Lett.407・2. 127-131 (1997)

S.Masuda：“大鼠肾小管中 OAT-K1 有机阴离子转运蛋白的 mRNA 分布和膜定位。”FEBS Lett.407・2（1997）。

T.Terada: "Recognition of β-lactam antibiotics by rat peptide trasnporters,PEPT1 and PEPT2,in LLC-PK_1 cells." Am.J.Physiol.273・5. F706-F711 (1997)

T.Terada：“大鼠肽转运蛋白 PEPT1 和 PEPT2 在 LLC-PK_1 细胞中的识别。Am.J.Physiol.273·5 (1997)。

T.Terada: "Interaction of β-lactam antibiotics with histidine residue of rat H^+/peptide cotransporters,PEPT1 and PEPT2." J.Biol.Chem.273・10. 5582-5585 (1998)

T.Terada：“β-内酰胺抗生素与大鼠 H^+/肽协同转运蛋白、PEPT1 和 PEPT2 的组氨酸残基的相互作用。J.Biol.Chem.273·10 (1998)。

T.Terada: "Characterization of stably transfected kidney epithelial cell line expressing rat H^+/peptide cotransporter PEPT1:localization of PEPT1 and transport of β-lactam antibiotics." J.Pharmacol.Exp.Ther.281・3. 1415-1421 (1997)

T.Terada：“表达大鼠 H^+/肽协同转运蛋白 PEPT1 的稳定转染肾上皮细胞系的表征：PEPT1 的定位和 β-内酰胺抗生素的转运。J.Pharmacol.Exp.Ther.281·3。” (1997)

H.Saito: "Cloning and characterization of a pH-sensing regulatory factor that modulates transport activity of the human H^+/peptide cotransporter,PEPT1." Biochem.Biophys.Res.Commun.237・3. 577-582 (1997)

H. Saito：“调节人类 H^+/肽协同转运蛋白 PEPT1 转运活性的 pH 感应调节因子的克隆和表征。Biochem.Biophys.Res.Commun.237·3 (1997)。