7回膜貫通型オーファン受容体を用いた新規生理活性ペプチドの探索、構造と機能の解析

利用七种跨膜孤儿受体寻找新型生物活性肽，并分析其结构和功能

• 批准号: 10771277
• 负责人: 須賀 比奈子
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771277/
• 关键词: Gタンパク質共役受容体; 融合蛋白質; 細胞内カルシウム; リガンド; cAMP; ファージペプチドライブラリ; cDNAクローニング; 受容体; Gタンパク質; PCR

1 既知の7回膜貫通型受容体(7TMR)との相同性に基づいてヒトゲノムの情報を検索し、数種の新規7TMR遺伝子を同定した。また、オーファン7TMR、GPRD及びSENRをcDNAクローニングし(DDBJに登録:AB012210,AB029611)、各種G蛋白質αサブユニット(Gα)との融合蛋白質cDNAを作製した。2 ウシ脳に、GPRDを発現させた培養細胞(CHO細胞)のcAMP産生を減少させる活性を見いだし、精製を試みた。(最近GPRDのリガンドはフラクタルカイン(FK)であることが報告された)3 バキュロウイルス蛋白発現系を用いて、Sf9細胞に融合蛋白質を発現させた。(1)SENR-Gαへの非水解性GTPアナログ[^<35>S]GTPγSの結合を促進する活性を、ウシ肺、胃、脳下垂体、脂肪組織、小腸、ブタ膵臓に見いだした。融合蛋白質にG蛋白質βγサブユニット(Gβγ)を共発現させると、活性は更に上昇した。ウシ肺より各種カラムを用いてこの活性の精製を行った。(昨秋SENRのリガンドはウロテンシンII(UII)であることが報告された)(2)GPRD-Gi2αは、[^<35>S]GTPγSの結合が恒常的に亢進しており、FK刺激で上昇し、Gβγの共発現で更に上昇した。ランダムな6merペプチドを提示するファージライブラリより、この活性を抑制するファージを得た。4 CHO細胞に融合蛋白質を発現させ、受容体に対するリガンドで刺激すると、細胞内Ca^<2+>濃度が上昇した。(1)SENR及びSENR-Gαは、内在性又は融合しているGqαと共役していることが示唆された。(2)GPRD及びGPRD-Giαは内在性Gi/oα又は融合しているGiαと、GPRD-Gqαは主に融合しているGqαと共役していることが示唆された。Gqα融合蛋白質は、他と比較して細胞内Ca^<2+>の上昇が高く、10倍低いFK濃度で反応を観測できた。

1. The identity of the known 7-layer through film receptor (7TMR) and the information of the 7-layer through film receptor are realized, and several new 7TMR receptors are determined cDNA preparation of fusion protein cDNAs for various G protein alpha proteins (Gα), GPRD, and SENR (DDBJ registry: AB012210, AB029611). 2. The cAMP production of cultured cells (CHO cells) was reduced and the activity was refined. (Recently, GPRD's fusion protein development system has been used in Sf9 cells.) (1) The activity of SENR-Gα-NH_2-GTP [^<35>S]GTPγS binding promoter is found in the lung, stomach, pituitary, subcutaneous fat, small intestine, and liver. Fusion protein G protein βγ (Gβγ) co-expression and activity increased. All kinds of active substances are used in the purification of the active substances. (2) The binding of GPRD-Gi2α and [^<35>S]GTPγS was constantly increased, FK stimulation increased, and Gβγ co-expression increased. The first step is to improve the quality of the product. 4. CHO cell fusion protein production, receptor stimulation, intracellular Ca^&lt;2+&gt; concentration increased (1)SENR and SENR-Gα are opposite, intrinsic and opposite to each other. (2)GPRD and GPRD-Giα reverse intrinsic Gi/oα reverse fusion, GPRD-Gqα reverse fusion, Gq α reverse fusion, Gqα reverse fusion. Gqα fusion protein increased intracellular Ca^&lt;2+&gt; by 10-fold compared with other proteins.