G蛋白共役型受容体の細胞内局在の分子機構の解析

G蛋白偶联受体细胞内定位的分子机制分析

• 批准号: 10771314
• 负责人: 平澤 明
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: National Research Institute for Child Health and Development
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771314/
• 关键词: α1Aアドレナリン受容体; α1Bアドレナリン受容体; yeast two-hybrid法; Green Fluorescent Protein; gClqBP; Green Fluorescent protein; フローサイトメトリー; レーザー共焦点顕微鏡

受容体の細胞内局在、およびその制御機構を解析するために、α1A,α1Bナドレナリン受容体をモデルとし、定量的実験が可能なフローサイトメトリーと、画像として可視化が可能なレーザー共焦点顕微鏡を組み合わせ解析を行ってきた。前年度は、受容体の蛍光標識にはエピトープタグ、GFP(Green Fluorescent protein)を融合した受容体コンストラクトを作製し、細胞内局在、輸送機構の直接的な可視化および、Real-timeでの観察を可能にした(Awaji et al,Mol Endcrino 1998)。さらに、受容体蛋白質を誘導発現できる培養細胞系を作製し、これを用いて局在、輸送機構に関する薬理学的な解析を行った(Hirasawa et al.Brit J Pharmacol 1998)。また、局在の制御に関与すると考えられる蛋白質の検索のため、yeast two-hybrid法を用いα1Bアドレナリン受容体に結合する蛋白質としてgClqBPの単離に成功した。本年度は、この蛋白質とα1Bアドレナリン受容体との相互作用について、より詳細に解析した。gClqBPのcDNAとα1Bアドレナリン受容体cDNAとをco-transfectすると、同一の細胞内局在を示すこと、その培養細胞を可溶化後抗α1Bアドレナリン受容体抗体で免疫沈降を行うとgClqBPが共沈することなどから、発現した細胞内でも相互作用のあることが分かった。さらに、上記蛍光検出系を組み合わせることで、gClqBPが実際にα1Bアドレナリン受容体の発現量を抑制することを明らかにした。また、相互作用するα1Bアドレナリン受容体側の部位をyeast two-hybrid法と顕微鏡での解析を組み合わせて検索したところ、C末端側のArgがクラスターを作った領域を含むことが分かった。以上、受容体の発現を蛋白レベルでの制御する可能性のある新規の因子を同定し、また相互作用部位についても新規のモチーフを見いだすことができた(Zjxu et al J Biol Chem 1999)。

The intracellular structure of the receptor, the control mechanism of the receptor, the quantitative analysis of the receptor, the visualization of the receptor, the combination of confocal microscopy and the analysis of the receptor. In the past year, the fluorescent labeling of receptors has been possible in the field of receptor control, intracellular localization, direct visualization of transport mechanisms, and Real-time detection of GFP(Green Fluorescent Protein) fusion (Awaji et al,Mol Endcrino 1998). In addition, the induction and development of receptor proteins in cultured cell lines were studied for the analysis of biological mechanisms related to their use in culture and delivery (Hirasawa et al. Brit J Pharmacol 1998). The protein was successfully isolated from the receptor by using the yeast two-hybrid method. This year, the protein α1B was analyzed in detail. gClqBP cDNA and α1B receptor cDNA co-transfection, the same intracellular region, solubilization of cultured cells after anti-α1B receptor antibody immuno-sedimentation, gClqBP co-precipitation, development of intracellular interaction In addition to the above, the light emission system is combined with the emission of the α1B receptor. The interaction between α1B and the receptor side is a two-hybrid method. The analysis of the micro-mirror is based on the analysis of the interaction between α 1B and the receptor side. These factors determine the possibility of regulation of receptor protein expression and the interaction site (Zjxu et al J Biol Chem 1999).

项目成果

Shinoura H., Take H., Hirasawa A. et al.: "Key amino acids of vasopressin V1a receptor responsible for the species difference in the affinity of OPC-21268"FEBS Letters. 466. 255-258 (2000)

Shinoura H.、Take H.、Hirasawa A. 等人：“加压素 V1a 受体的关键氨基酸负责 OPC-21268 亲和力的物种差异”FEBS Letters。

Hirasawa A,Awaji T,Sugawara T Tsujimoto A,Tsujimoto G.: "Differential mechanism for the cell surface sorting and the agonist-promoted internalization of a1B-adrenoceptor." Br.J.Pharmacol.124. 55-62. (1998)

Hirasawa A、Awaji T、Sugarara T Tsujimoto A、Tsujimoto G.：“细胞表面分选和激动剂促进 a1B 肾上腺素受体内化的不同机制。”

Xu J., Hirasawa A. et al.: "Interaction of α1B-adrenergic receptor with gC1q-R, a multifunctional protein"J. Biol. Chem.. 274(30). 21149-21154 (1999)

Xu J.、Hirasawa A. 等：“α1B-肾上腺素受体与多功能蛋白 gC1q-R 的相互作用”J. Biol. 274(30) (1999)。

Awaji T,Hirasawa A,Sugawara T,Izumi S,Tsujimoto G,et al: "Real-time optical monitoring of ligand-mediated internalization of α1b-adrenoceptor with green fluorescent protein." Mol.Endocrinol.12. 1099-1111 (1998)

Awaji T、Hirasawa A、Sugara T、Izumi S、Tsujimoto G 等人：“用绿色荧光蛋白实时光学监测 α1b-肾上腺素受体的内化。Mol.Endocrinol.1099-1111。” ）

平澤明、辻本豪三: "受容体タンパク質の細胞内輸送におけるソーティング"生体の科学. 50(6). 560-564 (1999)

Akira Hirasawa，Gozo Tsujimoto：“受体蛋白的细胞内转运的分类”生物科学 50(6) (1999)。