新規蛍光プローブを用いたG蛋白質共役型脂肪酸受容体ファミリー活性化機構の解析

利用新型荧光探针分析G蛋白偶联脂肪酸受体家族激活机制

• 批准号: 20659011
• 负责人: 平澤 明
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659011/
• 关键词: 分子生物学; ゲノム創薬科学; 蛍光ブロープ; GPR120; フローサイトメトリー; GPCR; 蛍光プローブ; 脂肪酸受容体

【分子内BRETによる受容体構造変化の探索】受容体のC末端にRlucを融合し、第三細胞内ドメインに蛍光プローブとしてvenusを挿入したコンストラクトを作成し、HEK細胞に発現させ、Rluc->venus間のBRET計測を行うことで、受容体の構造変化を検出する実験系を構築した。誘導発現細胞を懸濁した状態での蛍光分光器での検討および、共焦点顕微鏡を用いた検討を行った。この手法により蛍光プローブ間のトポロジーの解析を行う事が可能になった。さらに、多数のプローブ挿入部位について、上記の計測結果を比較することで、受容体構造のシグナル伝達系への寄与を明らかにすることが出来た。【新規蛍光プローブの開発と、受容体リガンド相互作用の解析】これまでG蛋白質共役型受容体(GPCR)である脂肪酸受容体GPR40, GPR120は、受容体-リガンド相互作用を直接的に調べる手法が確立されていなかったため、薬理学的な解析が行われてこなかった。今回我々はFLAGタグを結合した脂肪酸受容体タンパク質をSf9細胞に発現させ、可溶化し、免疫磁気ビーズに結合固定し、蛍光プローブであるC1-BODIPY-C12で標識するという方法で、脂肪酸受容体とリガンドの相互作用を直接的に検出できるフローサイトメトリーに基づいた結合分析法を開発した。この手法は、他の分析法ではモニターが困難だったGPCRsにも適用可能で、リガンドの高処理不クリーニング系に対しても有効であると考えられる。

[通过分子内BRET搜索受体结构变化]构建了一个实验系统，以通过在受体的C端融合RLUC融合来检测受体的结构变化，将金星作为荧光探针插入第三个细胞内结构域中，并在HEK细胞中表达了BRET测量，并在HEK细胞中表达了Bret测量。在荧光光谱仪中检查了细胞，其中悬浮了诱导表达，并使用共聚焦显微镜检查了结果。该技术使分析荧光探针之间的拓扑结构成为可能。此外，通过比较许多探针插入位点的上述测量结果，可以阐明受体结构对信号转导系统的贡献。 [新型荧光探针的开发和受体配体相互作用的分析]尚未在药理学上分析脂肪酸受体GPR40和GPR120，它们是G蛋白偶联受体（GPCR）（GPCR），因为尚未建立直接研究受体 - 受体 - 配体相互作用的方法。在本文中，我们开发了一种基于流式细胞仪的结合测定法，该测定法可以通过在SF9细胞中表达脂肪酸受体和配体之间的相互作用直接检测，并在SF9细胞中表达FLAG-TAG结合的脂肪酸受体蛋白，从而溶解它们，与免疫磁性珠结合，并用荧光探针探针C1-Bodipy-C12。该技术可以应用于GPCR，这可能难以通过其他分析方法进行监测，并且被认为对高加工，未清洁的配体系统有效。

项目成果

フローサイトメーターを用いた脂肪酸受容体のリガンド受容体直接相

使用流式细胞仪对脂肪酸受体进行配体受体直接相分析

• 发表时间: 2008
• 作者: M.Lu;F.Han;N.Shioda;S.Moriguchi.;Y.Shirasaki;ZH.Qin;K.Fukunaga;原貴史
• 通讯作者: 原貴史

脂肪酸受容体GPR120の代謝調節機構の解析

脂肪酸受体GPR120代谢调控机制分析

• 发表时间: 2010
• 作者: 平澤明;原貴史;市村敦彦;宮内諭;木村郁夫;輿水崇鏡;辻本豪三
• 通讯作者: 辻本豪三

FAT SENSING IN THE GUT

肠道中的脂肪传感

• 发表时间: 2008
• 作者: Akira Hirasawa;Gozoh Tsujimoto
• 通讯作者: Gozoh Tsujimoto

Distribution and regulation of protein expression of the free fatty acid receptor GPR120

• DOI: 10.1007/s00210-008-0390-8
• 发表时间: 2009-04-01
• 期刊: NAUNYN-SCHMIEDEBERGS ARCHIVES OF PHARMACOLOGY
• 影响因子: 3.6
• 作者: Miyauchi, Satoshi;Hirasawa, Akira;Tsujimoto, Gozoh
• 通讯作者: Tsujimoto, Gozoh

糖尿病と脂肪酸受容体ファミリー

糖尿病和脂肪酸受体家族

• 发表时间: 2009
• 作者: 平澤明;辻本豪三
• 通讯作者: 辻本豪三