新規蛍光プローブを用いたG蛋白質共役型脂肪酸受容体ファミリー活性化機構の解析

利用新型荧光探针分析G蛋白偶联脂肪酸受体家族激活机制

• 批准号: 20659011
• 负责人: 平澤 明
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659011/
• 关键词: 分子生物学; ゲノム創薬科学; 蛍光ブロープ; GPR120; フローサイトメトリー; GPCR; 蛍光プローブ; 脂肪酸受容体

【分子内BRETによる受容体構造変化の探索】受容体のC末端にRlucを融合し、第三細胞内ドメインに蛍光プローブとしてvenusを挿入したコンストラクトを作成し、HEK細胞に発現させ、Rluc->venus間のBRET計測を行うことで、受容体の構造変化を検出する実験系を構築した。誘導発現細胞を懸濁した状態での蛍光分光器での検討および、共焦点顕微鏡を用いた検討を行った。この手法により蛍光プローブ間のトポロジーの解析を行う事が可能になった。さらに、多数のプローブ挿入部位について、上記の計測結果を比較することで、受容体構造のシグナル伝達系への寄与を明らかにすることが出来た。【新規蛍光プローブの開発と、受容体リガンド相互作用の解析】これまでG蛋白質共役型受容体(GPCR)である脂肪酸受容体GPR40, GPR120は、受容体-リガンド相互作用を直接的に調べる手法が確立されていなかったため、薬理学的な解析が行われてこなかった。今回我々はFLAGタグを結合した脂肪酸受容体タンパク質をSf9細胞に発現させ、可溶化し、免疫磁気ビーズに結合固定し、蛍光プローブであるC1-BODIPY-C12で標識するという方法で、脂肪酸受容体とリガンドの相互作用を直接的に検出できるフローサイトメトリーに基づいた結合分析法を開発した。この手法は、他の分析法ではモニターが困難だったGPCRsにも適用可能で、リガンドの高処理不クリーニング系に対しても有効であると考えられる。

[Exploration of receptor structure transformation in intramolecular BRET] Construction of receptor structure transformation system in which Rluc is fused at C-terminal of receptor, Rluc->venus is inserted into receptor, HEK cell is generated, BRET measurement is performed between Rluc->venus, and receptor structure transformation is detected. Inducing the cell suspension state, the detection of the fluorescence spectrometer, and the detection of the confocal microscope This is the first time I've ever seen a woman. In addition, most of the test results were compared with those of the test results. The test results showed that the test results of the test results were similar to those of the test results. [Analysis of receptor interactions] This is a direct modulation method for the development of G protein co-active receptor (GPCR) fatty acid receptors GPR40, GPR120 and receptor-receptor interactions. In this paper, we developed a method for direct detection of fatty acid receptor interactions in SF9 cells by FLAG binding, solubilization, immunomagnetic binding, immobilization, and fluorescence analysis. This method is not only difficult to analyze, but also applicable to GPCRs.

项目成果

フローサイトメーターを用いた脂肪酸受容体のリガンド受容体直接相

使用流式细胞仪对脂肪酸受体进行配体受体直接相分析

• 发表时间: 2008
• 作者: M.Lu;F.Han;N.Shioda;S.Moriguchi.;Y.Shirasaki;ZH.Qin;K.Fukunaga;原貴史
• 通讯作者: 原貴史

Synthesis and application of fluorescein- and biotin-labeled molecular probes for the chemokine receptor CXCR4

• DOI: 10.1002/cbic.200700761
• 发表时间: 2008-05-05
• 期刊: CHEMBIOCHEM
• 影响因子: 3.2
• 作者: Oishi, Shinya;Masuda, Ryo;Fujii, Nobutaka
• 通讯作者: Fujii, Nobutaka

脂肪酸受容体GPR120の代謝調節機構の解析

脂肪酸受体GPR120代谢调控机制分析

• 发表时间: 2010
• 作者: 平澤明;原貴史;市村敦彦;宮内諭;木村郁夫;輿水崇鏡;辻本豪三
• 通讯作者: 辻本豪三

Identification of G protein-coupled receptor 120-selective agonists derived from PPARgamma agonists

源自 PPARgamma 激动剂的 G 蛋白偶联受体 120 选择性激动剂的鉴定

• 发表时间: 2008
• 期刊: J Med Chem. 51(23)
• 作者: Suzuki T;Igari S I;Hirasawa A;Hata M;Ishiguro M;Fujieda H;Itoh Y;Hirano T;Nakagawa H;Ogura M
• 通讯作者: Ogura M

トランスポゾンを用いたランダム変異導入によるタンパク質標識および機能解析法

使用转座子的随机诱变的蛋白质标记和功能分析方法

• 发表时间: 2009
• 作者: 平澤明;平井絢子;寺西文恵;伊津野彩子;辻本豪三
• 通讯作者: 辻本豪三