G蛋白質共役受容体の細胞内動態の解析

G蛋白偶联受体的细胞内动力学分析

• 批准号: 07772212
• 负责人: 平澤 明
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: National Research Institute for Child Health and Development
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 1996
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772212/
• 关键词: アドレナリン受容体; フローサイトメトリー; 共焦点レーザー顕微鏡; リン酸化; ソーティング

G蛋白共役型の受容体の細胞内での分布の変化と、それに関して役割を果たすと考えられる受容体構造に関しての解析を試みた。そのために、細胞表面へ局在したα_<1b>アドレナリン受容体を抗受容対抗体を用いたフローサイトメトリーにより検出定量する実験系と、共焦点レーザー顕微鏡で、細胞内の受容体の局在をより詳細に観察できる実験系の確立に成功した。七回膜貫通型受容体の構造上、高度に保存されている第七膜貫通ドメイン後部のチロシン一残基に変位を加えるだけで、受容体の細胞表面へのソーティングは全く認められなくなった。またリガンドに対する結合も全く起こらないことから、この配列が受容体自身の構造を保つ上で必須であることが示唆された。一方、第三細胞内ドメイン中でセリン・スレオニン残基に富み、リン酸化を受ける可能性が考えられる部分を全てアラニンに変異させたところ、定常状態での受容体の分布に関しては変化がないことが、明らかになった。現在、アゴニスト刺激時および、リン酸化促進状態と考えられる状態での分布を検討することで、その役割を詳細に検討中である。今回我々が確立した方法以上に高感度かつ信頼性のある解析方法は現時点では存在せず、今後もより詳細な受容体構造の解析、たとえば、受容体の細胞内への移行と受容体自身のリン酸化との間の関係などを明らかにできることが期待される。

我们试图分析细胞内G蛋白偶联受体分布的变化以及被认为在这种情况下起作用的受体结构的变化。因此，我们成功地建立了一个实验系统，在该系统中，使用抗受体对抗体的α_<1b>肾上腺素能受体被定位于细胞表面，并通过流式细胞仪进行了定量，其中一个实验系统可以使用共插孔激光器显微镜在细胞中进行更多详细观察到细胞中受体的定位。由于七个跨膜受体的结构，仅在第七跨膜结构域的后部仅位移酪氨酸残基，就不再观察到受体分类到细胞表面。此外，没有与配体的结合发生，这表明该序列对于维持受体本身的结构至关重要。另一方面，当富含丝氨酸 - 硫代蛋白残基并被认为是磷酸化的第三个细胞结构域的所有部分被突变为丙氨酸时，据显示，稳态下受体分布没有变化。当前，正在通过检查激动剂刺激期间的分布以及被认为是预磷酸化状态的条件来详细研究的作用。目前，没有什么比我们建立的方法更敏感和可靠的分析方法了，希望将来对受体结构进行更详细的分析，例如受体转移到细胞中的关系与受体本身的磷酸化之间的关系。

项目成果

Hirasawa A, Tsujimoto G, et al.: "Cloning, functional expression and tissue distribution of human α_<1C>-adrenoceptor splice variants." FEBS Letters. 363. 256-260 (1995)

Hirasawa A、Tsujimoto G 等人：“人 α_<1C>-肾上腺素受体剪接变体的克隆、功能表达和组织分布。FEBS Letters 363. 256-260 (1995)。