軟体動物トロポニンIのN端伸長領域の存在意義の研究

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1.ホタテガイ類TnIの一次構造と機能の相関の検討アカザラガイTnIのcDNAを鋳型として種々の領域をPCR増幅し、それらを発現ベクターに組み込んで大腸菌によるTnI断片発現系を構築した。現在、N端伸長領域を含む断片の発現には至っておらず、脊椎動物TnIと相同性を示すC端側の領域に含まれる残基130-292、残基130-252および残基231-292の領域について発現を行った。さらにこれらの領域に相当するウサギTnIの領域についても同様にして発現系を構築した。これらの断片のTnCとの結合能を比較した結果、残基231-292について、ウサギTnIではCa依存的な強い結合が認められるのに対し、アカザラガイTnIでは全く結合しないなどの大きな相異が認められた。従って、アカザラガイTnIの収縮調節における作用機構は脊椎動物TnIのそれとは異なっていることが示唆された。2.N端伸長領域と相互作用する蛋白質の酵母Two-Hybrid systemによる検索アカザラガイTnIのN端伸長領域にあたる残基1-129、脊椎動物TnIと相同性を示す残基130-292およびTnC結合部位である残基130-183の領域をコードするDNAを調製し、それらをpHybLex/Zeoベクターに組み込んで酵母EGY48(pSH18-34)を形質転換した。さらにそれらをpYESTrp2ベクターに構築したアカザラガイ横紋筋cDNAライブラリーで形質転換し、Leu非要求性およびLacZの発現を指標として、上述の領域と相互作用する蛋白質を検索した。その結果、残基130-292に関してはTnCおよびTnTが、残基130-183に関してはTnCが相互作用蛋白質として検出されるなど予想通りの結果が得られる一方で、N端伸長領域である残基1-129に関しては相互作用蛋白質を検出するには至らなかった。