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ナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の頂部細胞膜局在機構の分子形態学の解析

钠离子依赖性糖转运蛋白SGLT1顶膜定位机制的分子形态分析

基本信息

批准号：
11770002
负责人：
鈴木健史
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は,糖輸送体の高度に分化した高等動物組織細胞内での局在分布機構,特に間接的にエネルギーを消費し能動的に糖を細胞に取り込むナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の頂部細胞膜への移送経路の解明を目的に行った.SGLT1遺伝子の発現を自在にコントロールする事によってその頂部細胞膜局在メカニズムを移送・局在機構を分離して解析するために,培地に添加するドキシサイクリンの濃度に応じてSGLT1遺伝子発現のオン・オフと発現量を調節できるシステムをMDCK細胞に組み込んだTetOff-SGLT1遺伝子発現システムを構築した.さらにこのシステムを利用し,ドキシサイクリンを培地から除去しSGLT1を発現誘導した後に培地にテトラサイクリンを再添加し遺伝子発現を停止させチェイス培養するパルス発現-チェイス培養システムを構築した.様々な時間チェイス培養した後にMDCK細胞を固定し,発現産物の細胞内局在を,凍結準超薄切片蛍光抗体染色法,共焦点レーザー顕微鏡法,蛍光顕微鏡法,免疫電子顕微鏡法などを組み合わせ解析する事によって,SGLT1が細胞内で合成された後に直接頂部細胞膜に移送されていることが明らかとなった.現在このシステムを用いて,SGLT1の頂部細胞膜への直接的な移送システムが細胞極性形成過程の何処で構築されるのかを解析中である.

In this study, the distribution mechanism of sugar transporters in cells of higher animal tissues was studied. In particular, the indirect production process of SGLT1 protein is characterized by its ability to consume active sugars in cells, and its ability to isolate and analyze SGLT1 protein from the top cell membrane of SGLT1 protein. The concentration of TetOff-SGLT1 gene in MDCK cells was adjusted by the concentration of TetOff-SGLT1 gene. In addition, the development and culture system was constructed after the SGLT1 gene was removed and the SGLT1 gene was re-added. After culture, MDCK cells were fixed and the intracellular structure of the product was detected. The frozen quasi-ultrathin sections were stained with antibodies, confocal microscopy, fluorescence microscopy, immunoelectron microscopy, and the results were analyzed. SGLT1 was synthesized in cells and transferred directly to the apical cell membrane. Now the system is used to analyze the direct transfer of SGLT1 top cell membrane and the structure of cell polarity formation process.