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EBウイルスがコードする小RNA(EBER)に結合する蛋白の同定と機能解析

与 EB 病毒编码的小 RNA (EBER) 结合的蛋白质的鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
11770153
负责人：
丸尾聖爾
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

EBウイルスがコードする小RNA(EBER)は細胞にアポトーシス耐性を賦与することが明らかとなっているが、その詳細な機序は不明である。EBERの活性発現の機序を知るためにはEBER結合蛋白質の同定が必要と考えられるが、網羅的なスクリーニングは行われていない。そこで、three-hybridシステムを用い、EBER結合蛋白質のスクリーニングを行うこととした。最初に、このシステムでEBERとEBER結合蛋白質の結合が検出可能か否かを確認するために、既知のEBER結合蛋白質とEBER1、2との結合を解析した。その結果、その内の一つであるPKRとEBER2との特異的な結合が示された。そこで、ライブラリーのスクリーニングに移った。スクリーニングは、EBウイルス感染不死化B細胞から調製したcDNAライブラリーをEBER2と共に酵母で発現させることにより行った。ライブラリー由来蛋白質とEBER2を共発現する936万の酵母クローンを、EBER2への結合の指標であるレポーター遺伝子の発現によりスクリーニングしたところ、3125の陽性クローンが得られた。さらに、これらを同様の別のレポーター遺伝子の発現によりスクリーニングしたところ、2913が陽性となった。次に、EBER2との結合に関係なくレポーターを発現させる疑陽性クローンを排除するために、EBER2非共存下ではレポーターを発現しないクローンをスクリーニングしたところ266クローンが残った。これらのクローンについて制限酵素消化パターンの解析および塩基配列決定によりインサートを解析したところ、既知のEBER結合蛋白質であるEAPが重複して含まれていることが分かり、スクリーニングは適切に行われていることが示唆された。現在はその他のクローンについて詳細な解析を進めている。

EBER is a small RNA that confers tolerance to cell types. To understand the mechanism of EBER activity, it is necessary to study the identity of EBER binding proteins. The three-hybrid system is used to bind EBER protein. Initially, the binding of EBER to EBER binding proteins was detected and confirmed. The binding of known EBER binding proteins to EBER 1 and 2 was analyzed. PKR and EBER 2 are specific combinations of PKR and EBER 2.そこで、ライブラリーのスクリーニングに移った。EBER 2 is a yeast cell that can be infected with B cells. 9.36 million yeast samples were co-detected with EBER2, and 3125 positive samples were detected with EBER2 binding index. In addition to the above, the two groups of people are also different. Second, EBER 2 and the combination of the relationship between the two, EBER 2 and the blue shift, EBER 2 and the blue shift, EBER 2 and the blue shift. The analysis of enzyme digestion and the determination of base alignment are the most important aspects of EBER-binding protein analysis. EAP duplication is the most important aspect of EBER binding protein analysis. Now he's going to have a detailed analysis.