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トロンボキサンA2受容体αおよびβのG12ファミリー蛋白制御機構の解析

血栓素A2受体α、βG12家族蛋白调控机制分析

基本信息

批准号：
11770366
负责人：
田島裕久
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)Thromboxane A2 receptor(TXR)mutant TXR-R60Lの共役G蛋白のスクリーニングTXRのR60L変異体はmild breeding disorderを引き起こす。京都大学成宮教授より供与された、TXR-αR60L、βR60L cDNAを、C端がG蛋白サブクラス特異的なGs hybridと共にCOS細胞に共発現し、TXA2アゴニストであるU46619を処理してcAMP産生を測定した。共導入したLacZ遺伝子にて補正された結果からTXR-αR60LはR60Lの変異の導入によってGq,G14,G16に対するcAMP応答性は残存するがG12ファミリーに対するcAMP応答性は消失した。このことがらR60Lの変異によりTXRはG12ファミリーへの共役能を失う可能性が示唆された。(2)TXR-α,βのG12ファミリーとの共役前年度にGs hybridを用いた実験より、TXR-αはG12,G13と、βはG13のみ共役しTXRのC末端欠損体TXR-Ctrを用いた実験よりTXR-βのC末端にはG12との共役を抑制する領域が存在する可能性が示唆された。この実験を元に今年度はTXR-βのC端領域のみを含むプラスミドTXR-β-Ctailを構築しその共役抑制機能を検討した。TXR-αをGs/12あるいはGs/13と共にCOS細胞に発現させU-46619刺激したところ、濃度依存的にcAMPの上昇が見られた。さらにTXR-β-Ctailを共発現したが、Gs/12とGs/13を発現させた細胞の間で差異が見られなかった。また、TXR及びc-Jun-N-terminal kinase(JNK)を共発現させ内在性のG12に対するTXR-β-Ctailの共役抑制効果を測定したが、TXR-β-Ctailの抑制効果は観察できなかった。TXR-β-Ctailの抑制効果が検出できなかった原因としては、この蛋白が適切なfoldingができずに抑制効果を示せなかった可能性、あるいは適切な細胞内局在ができずに抑制効果を示せなかった可能性などが考えられる。今後は、TXR-β-Ctailの高次構造も考慮に入れつつ測定法に改良を加えさらに探究していく予定である。

(1)Thromboxane A2 receptor(TXR)mutant TXR-R60L co-active G protein expression profile TXR and R60L variant induced mild breeding disorder. Professor Narimiya, Kyoto University, TXR-α R60L, β R60L cDNA, C-terminal G protein specific Gs hybrid and COS cell co-production, TXA2 treatment and cAMP production measurement The results of co-introduction of LacZ gene correction were TXR-α R60L and R60L, respectively. The cAMP response of Gq,G14 and G16 was not detected, but the cAMP response of G12 was not detected. The difference between TXR and G12 is that the common function of R60L is impossible. (2) The possibility of the existence of a domain in which TXR-α,β and G12 share the common service prior to the common service, TXR-α and G13 share the common service prior to the common service, and TXR-β and G12 share the common service prior to the common service. This year, we will discuss the common service suppression function of TXR-β-Ctail. TXR-α was found in COS cells stimulated by U-46619 and concentration-dependent cAMP increase was observed. TXR-β-Ctail was found in the cells of Gs/12 and Gs/13. TXR, TXR and c-Jun-N-terminal kinase(JNK) are co-produced and intrinsic to G12. The co-active inhibition effect of TXR-β-Ctail is determined and the inhibition effect of TXR-β-Ctail is observed. TXR-β-Ctail inhibition effect is detected by folding, and the protein is appropriately folded to show the inhibition effect. In the future, TXR-β-Ctail and higher-order structures should be considered for improvement of the measurement method.