トロンボキサンA2受容体αおよびβのG12ファミリー蛋白制御機構の解析

(1)Thromboxane A2 receptor(TXR)mutant TXR-R60Lの共役G蛋白のスクリーニングTXRのR60L変異体はmild breeding disorderを引き起こす。京都大学成宮教授より供与された、TXR-αR60L、βR60L cDNAを、C端がG蛋白サブクラス特異的なGs hybridと共にCOS細胞に共発現し、TXA2アゴニストであるU46619を処理してcAMP産生を測定した。共導入したLacZ遺伝子にて補正された結果からTXR-αR60LはR60Lの変異の導入によってGq,G14,G16に対するcAMP応答性は残存するがG12ファミリーに対するcAMP応答性は消失した。このことがらR60Lの変異によりTXRはG12ファミリーへの共役能を失う可能性が示唆された。(2)TXR-α,βのG12ファミリーとの共役前年度にGs hybridを用いた実験より、TXR-αはG12,G13と、βはG13のみ共役しTXRのC末端欠損体TXR-Ctrを用いた実験よりTXR-βのC末端にはG12との共役を抑制する領域が存在する可能性が示唆された。この実験を元に今年度はTXR-βのC端領域のみを含むプラスミドTXR-β-Ctailを構築しその共役抑制機能を検討した。TXR-αをGs/12あるいはGs/13と共にCOS細胞に発現させU-46619刺激したところ、濃度依存的にcAMPの上昇が見られた。さらにTXR-β-Ctailを共発現したが、Gs/12とGs/13を発現させた細胞の間で差異が見られなかった。また、TXR及びc-Jun-N-terminal kinase(JNK)を共発現させ内在性のG12に対するTXR-β-Ctailの共役抑制効果を測定したが、TXR-β-Ctailの抑制効果は観察できなかった。TXR-β-Ctailの抑制効果が検出できなかった原因としては、この蛋白が適切なfoldingができずに抑制効果を示せなかった可能性、あるいは適切な細胞内局在ができずに抑制効果を示せなかった可能性などが考えられる。今後は、TXR-β-Ctailの高次構造も考慮に入れつつ測定法に改良を加えさらに探究していく予定である。

(1)Thromboxane A2 receptor(TXR)mutant TXR-R60Lの共役G蛋白のスクリーニングTXRのR60L変異体はmild breeding disorderを引き起こす。京都大学成宮教授より供与された、TXR-αR60L、βR60L cDNAを、C端がG蛋白サブクラス特異的なGs hybridと共にCOS細胞に共発現し、TXA2アゴニストであるU46619を処理してcAMP産生を測定した。共導入したLacZ遺伝子にて補正された結果からTXR-αR60LはR60Lの変異の導入によってGq,G14,G16に対するcAMP応答性は残存するがG12ファミリーに対するcAMP応答性は消失した。このことがらR60Lの変異によりTXRはG12ファミリーへの共役能を失う可能性が示唆された。(2)TXR-α,βのG12ファミリーとの共役前年度にGs hybridを用いた実験より、TXR-αはG12,G13と、βはG13のみ共役しTXRのC末端欠損体TXR-Ctrを用いた実験よりTXR-βのC末端にはG12との共役を抑制する領域が存在する可能性が示唆された。この実験を元に今年度はTXR-βのC端領域のみを含むプラスミドTXR-β-Ctailを構築しその共役抑制機能を検討した。TXR-αをGs/12あるいはGs/13と共にCOS細胞に発現させU-46619刺激したところ、濃度依存的にcAMPの上昇が見られた。さらにTXR-β-Ctailを共発現したが、Gs/12とGs/13を発現させた細胞の間で差異が見られなかった。また、TXR及びc-Jun-N-terminal kinase(JNK)を共発現させ内在性のG12に対するTXR-β-Ctailの共役抑制効果を測定したが、TXR-β-Ctailの抑制効果は観察できなかった。TXR-β-Ctailの抑制効果が検出できなかった原因としては、この蛋白が適切なfoldingができずに抑制効果を示せなかった可能性、あるいは適切な細胞内局在ができずに抑制効果を示せなかった可能性などが考えられる。今後は、TXR-β-Ctailの高次構造も考慮に入れつつ測定法に改良を加えさらに探究していく予定である。