放射線や活性酸素が誘発する塩基置換突然変異の由来とその修復酵素の研究

辐射和活性氧诱导的碱基取代突变的起源及其修复酶的研究

• 批准号: 11780391
• 负责人: 張 秋梅
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780391/
• 关键词: 放射線; 活性酸素; 突然変異; 5-フォルミルウラシル; 修復酵素; 塩基置換; 酸化的損傷; DNAグリコシラーゼ

本研究の目的は、チミンのメチル基へのOHラジカルの付加反応によって生じる5-フォルミルウラシル(5-foU)の修復酵素を大腸菌から同定することである。APリアーゼ活性を持つDNAグリコシラーゼはシッフ塩基中間体を形成するが、このときNaBH_4で還元すると、DNAとグリコシラーゼが共有結合するようになる。この反応を利用して、5-foUを含むオリゴヌクレオチドにトラップされる大腸菌のタンパクを同定し、5-foU部位での鎖切断および5-foUによるinvivo突然変異に対する抑制について検討した。大腸菌野生株の抽出液と5-foUを含む二重鎖オリゴヌクレオチド(17-mers)をNaBH_4存在下で反応させると、3種類の異なるタンパクが関与する複合体の形成が観察された。様々のDNA修復酵素欠損株の抽出液を用いたトラッピング反応の結果、大腸菌mutM、nthおよびnei変異株の抽出液では、3種類のタンパクのうちの1つがそれぞれ消失した。大腸菌mutM nthnei変異株では5-foU-DNAにトラップされるタンパクはすべて検出できなかった。さらに、正常なmutM、nth、nei遺伝子を大腸菌mutM nthnei変異株に導入すると、それぞれの変異株の抽出液で検出できなかった複合体の形成が回復した。次に、MutM、NthおよびNeiタンパクを精製した。これらの精製タンパクはNaBH_4存在下で5-foU-オリゴヌクレオチドと複合体を形成することが分かった。さらに、MutM、Nth、Neiタンパクはいずれも、5-foUの部位で二重鎖のオリゴヌクレオチドを切断することを明らかにした。次に、5-foUを含むプラスミドpSVK3を大腸菌のmutM nth neialkA変異株の中で複製させたところ、その突然変異頻度は野生株、alkA株の場合に比べて有意に増大した。これらの結果は、MutM、Nth、Neiタンパクは、大腸菌における5-フォルミルウラシル修復酵素であることを示している。さらに、ヒトhNTH1タンパクが5-foUを含んだオリゴヌクレオチドとシッフ塩基中間体を形成すること、そのオリゴヌクレオチドを切断することが分かった。

は の purpose, this study チ ミ ン の メ チ ル base へ の OH ラ ジ カ ル の plus the 応 に よ っ て raw じ る 5 - フ ォ ル ミ ル ウ ラ シ ル (5 - foU) の repair enzyme を coliform か ら with fixed す る こ と で あ る. AP リ ア ー ゼ active を hold つ DNA グ リ コ シ ラ ー ゼ は シ ッ フ salt formed intermediates を す る が, こ の と き NaBH_4 で also yuan す る と, DNA と グ リ コ シ ラ ー ゼ が mutual combination す る よ う に な る. こ の anti 応 を using し て, 5 - foU を containing む オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド に ト ラ ッ プ さ れ る coliform の タ ン パ ク を with fixed し, 5 - foU で の lock cut お よ び 5 - foU に よ る invivo suddenly - different に す seaborne る inhibit に つ い て beg し 検 た. Coliform wild strains の extract と 5 - foU を containing む double lock オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (17 - mers) を NaBH_4 で in the presence of anti 応 さ せ る と, 3 species の different な る タ ン パ ク が masato and す る complex の form が 観 examine さ れ た. Owe others 々 の DNA repair enzyme damage strain の extract を with い た ト ラ ッ ピ ン グ anti 応 の results, coliform mutM, NTH お よ び nei - different strains の extract で は, 3 species の タ ン パ ク の う ち の 1 つ が そ れ ぞ れ disappear し た. Coliform mutM nthnei - different strains で は 5 - foU - DNA に ト ラ ッ プ さ れ る タ ン パ ク は す べ て 検 out で き な か っ た. さ ら に, normal な mutM, NTH, nei but 伝 を coliform mutM nthnei - different strains に import す る と, そ れ ぞ れ の - different strains の extract で 検 out で き な か っ た complex の reply form が し た. Subgrade に, MutM, NthおよびNeiタ パ パ を を refining た た. こ れ ら の refined タ ン パ ク は NaBH_4 で in the presence of 5 - foU - オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と complex を form す る こ と が points か っ た. さ ら に, MutM, Nth, Nei タ ン パ ク は い ず れ も, 5 - foU の parts で double lock の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を cut す る こ と を Ming ら か に し た. に, 5 - foU を containing む プ ラ ス ミ ド pSVK3 を coliform の mutM NTH neialkA variations in different strains の で copy さ せ た と こ ろ, そ の suddenly - different frequency は wild seedlings の occasions, alkA に than べ て intentionally に raised large し た. こ れ ら の results は, MutM, Nth, Nei タ ン パ ク は, coliform に お け る 5 - フ ォ ル ミ ル ウ ラ シ ル repair enzyme で あ る こ と を shown し て い る. さ ら に, ヒ ト hNTH1 タ ン パ ク が 5 - foU を containing ん だ オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と シ ッ フ salt formed intermediates を す る こ と, そ の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を cut す る こ と が points か っ た.

项目成果

I.Miyabe,Q.-M.Zhang,K.Kino,H.Sugiyama and S.Yonei: "Mutagenic effects of 5-formyluracil on a plasmid vector during replication in Escherichia coli"International Journal of Radiation Biology. 77. 54-58 (2001)

I.Miyabe、Q.-M.Zhang、K.Kino、H.Sugiyama 和 S.Yonei：“大肠杆菌复制过程中 5-甲酰尿嘧啶对质粒载体的诱变作用”国际放射生物学杂志。

Q.-M,Zhang: "Role of the Escherichia coli and human DNA glycosylases that remove 5-formyl uracil from DNA in the prevention of mutations"Journal of Radiation Research. (印刷中). (2001)

Q.-M，Zhang：“大肠杆菌和人类 DNA 糖基化酶从 DNA 中去除 5-甲酰基尿嘧啶在预防突变中的作用”（正在出版）。

Y.Matsumoto,Q.-M.Zhang,M.Takao A.Yasui and S.Yonei: "Escherichia coli Nth and human hNTH1 DNA glycosylases are involved in removal of 8-oxoguanine from 8-oxoguanine/guanine mispairs in DNA"Nucleic Acids Research. (印刷中). (2001)

Y.Matsumoto、Q.-M.Zhang、M.Takao A.Yasui 和 S.Yonei：“大肠杆菌 Nth 和人 hNTH1 DNA 糖基化酶参与从 DNA 中的 8-氧代鸟嘌呤/鸟嘌呤错配中去除 8-氧代鸟嘌呤”酸研究（正在出版）（2001）。

Zhang,Q.-M.,N.Ishikawa,T.Nakahara and S.Yonei: "Escherichia coil MutY protein has a guanine-DNA glycosylase that acts on 7,8-dihydro-8-oxoguanine : guanine mispair to prevent spontaneous G:C-C:G transversions"Nucleic Acids Res.. 26. 4669-4675 (1999)

张，Q.-M.，N.Ishikawa，T.Nakahara 和 S.Yonei：“大肠杆菌 MutY 蛋白具有鸟嘌呤-DNA 糖基化酶，作用于 7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤：鸟嘌呤错配以防止自发 G

Zhang,Q.-M.,I.Miyabe,K.Hashiguchi and S.Yonei: "Free Radicals in Chemistry, Biology and Medicine 2000"OICA,London. 518 (2000)

张，Q.-M.，I.Miyabe，K.Hashiguchi 和 S.Yonei：“化学、生物学和医学中的自由基 2000”OICA，伦敦。