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真核細胞における酸化的塩基損傷の修復酵素の同定と突然変異抑制における役割

真核细胞氧化碱损伤修复酶的鉴定及其在突变抑制中的作用

基本信息

批准号：
13214056
负责人：
張秋梅
金额：
$ 3.26万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、チミンのメチル基へのOHラジカルの付加反応によって生じる5-フォルミルウラシル(5-foU)の修復酵素を酵母およびヒト細胞から同定することである。APリアーゼ活性を持つDNAグリコシラーゼはシッフ塩基中間体を形成するが、このときNaBH_4で還元すると、DNAとグリコシラーゼが共有結合するようになる。この反応を利用して、5-foUを含むオリゴヌクレオチドにトラップされる酵母のタンパク質を同定し、5-foU部位での鎖切断について検討した。出芽酵母(S.cerevisiae)野生株の抽出液と5-foUを含む二重鎖オリゴヌクレオチドをNaBH_4存在下で反応させると、2種類の異なるタンパク質が関与する複合体の形成が観察された。様々のDNA修復酵素欠損株の抽出液を用いたトラッピング反応の結果、ntg1およびntg2変異株の抽出液では、2種類のタンパク質のうちの一つがそれぞれ消失した。ntg1 ntg2変異株では5-foU-DNAにトラップされるタンパク質はすべて検出できなかった。さらに、正常なNtg1、Ntg2遺伝子を大腸菌mutMnthnei変異株に導入すると、それぞれの変異株の抽出液で検出できなかった複合体の形成が回復した。次に、これらのタンパク質を精製した。これらの精製タンパク質はNaBH_4存在下で5-foUを含むオリゴヌクレオチドと複合体を形成することが分かった。さらに、Ntg1、Ntg2タンパク質はいずれも、5-foUの部位で二重鎖のオリゴヌクレオチドを切断することが明らかになった。これらの酵素は大腸菌Nthタンパク質のホモログであり、チミングリコールの修復酵素として同定されたものである。5-foUに対する切断反応の比活性はチミングリコールを基質とした場合の約1/4〜1/3であり、いずれの場合もβ脱離で切断を起こすことから、Ntg1、Ntg2タンパク質は自然の基質として5-foUを認識したと結論した。さらに、ヒトhNTH1タンパク質が5-foUを含むオリゴヌクレオチドとシッフ塩基中間体を形成すること、そのオリゴヌクレオチドを部位特異的に切断することを見いだした。

The purpose of this study was to investigate the effects of 5-foU (5-foU) repair enzymes on the production of 5-foU repair enzymes in yeast and cell cultures. AP activity is dependent on DNA binding. DNA binding is dependent on DNA binding. The reaction time, the 5-foU position, the 5-foU position, the The formation of 5-foU complex in extract of S.cerevisiae wild strain in presence of NaBH_4 was investigated. DNA repair enzyme deficient extract of the plant is used in the middle of the reaction, ntg1 and ntg2 are different extract, 2 kinds of DNA repair enzyme are different extract, and all kinds of DNA repair enzyme are disappeared. ntg1 ntg2 mutant strain is 5-foU-DNA mutant. The normal Ntg1 and Ntg2 genes were introduced into E. coli mutants, and the mutants were extracted from E. coli mutants. Second, the quality of the product is refined. In the presence of NaBH_4, the 5-foU complex was formed. Ntg1, Ntg2, Ntg3, Ntg4, Ntg5, Ntg6, Ntg7, Ntg8, Ntg9, Ntg9, Ntg9, This enzyme is the most important enzyme in E. coli. The specific activity of the 5-foU is about 1/4 ~ 1/3 of the time when the substrate is cut off. The 5-foU is about 1/3 of the time when the substrate is cut off. In addition, the hNTH1 protein has a 5-foU structure, which includes the formation of a site-specific intermediate, and the formation of a site-specific intermediate.