孔辺細胞原形質膜H^+-ATPaseの活性化に関与するプロテインキナーゼの同定

参与保卫细胞质膜 H^+-ATPase 激活的蛋白激酶的鉴定

• 批准号: 12740440
• 负责人: 木下 俊則
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12740440/
• 关键词: 青色光; 孔辺細胞; H^+-ATPase; Two-hybrid-system; プロテインキナーゼ; 気孔; ソラマメ; 原形質膜; Two-hybrid system; 免疫沈降

本研究では、孔辺細胞原形質膜H^+-ATPaseの活性化に関わるプロテインキナーゼを含めH^+-ATPaseと直接相互作用するタンパク質のcDNAを酵母のTwo-hybrid法により単離し、その機能を明らかにすることを目的として研究を進めてきた。スクリーニングには主に原形質膜H^+-ATPaseのC末端領域を用いて行った。これは原形質膜H^+-ATPaseが活性化される際にこの領域がリン酸化され、原形質膜H^+-ATPaseを直接リン酸化するプロテインキナーゼや脱リン酸化するホスファターゼはこの領域を認識している可能性が高いためである。これまで、ソラマメ孔辺細胞のcDNAライブラリー由来の約1500万コロニーをスクリーニングし、300個の陽性クローンを単離した。現在、これら陽性クローンのシークエンス作業を進めているところであるが、cDNAの明らかとなったものとして、ATP/GTP-binding site motif AをもつLEA-like proteinやvestitone reductatseやphosphate transporterや多くのunknown proteinがある。これらの陽性クローンはTwo-hybrid法では間違いなく相互作用するものであるが、本当に細胞内で原形質膜H^+-ATPaseと相互作用するかは不明であり、今後の解析が非常に重要である。今後は、これらのタンパク質のうち相互作用の強いものやアミノ酸配列から機能が明確なもの(たとえばキナーゼやホスファターゼなど)を選び、シロイヌナズナのノックアウトラインにおける気孔の開閉やin vitroでの原形質膜H^+-ATPase活性に対する影響を調べ、その機能を証明する予定である。

This study is aimed at further research on the activation of protoplasma H^+-ATPase by Two-hybrid method, including direct interaction between protoplasma H^+-ATPase and yeast cDNA. The C-terminal domain of the protoplasmic H^+-ATPase was used in the study. This is a highly probable result of direct acidification of protoplasma H ^+-ATPase in the activated domain. About 15 million cDNA fragments were isolated from these cells, and 300 positive cDNA fragments were isolated. At present, there are many unknown proteins such as LEA-like protein, vestitone reductase, phosphate transporter and ATP/GTP-binding site motif A. There is no obvious interaction between these positive molecules and the Two-hybrid method, and the interaction between the protoplasmic plasma membrane H^+-ATPase and the protoplasmic plasma membrane H^+-ATPase in the cell is unknown. Future analysis is very important. In the future, the effect of the interaction between the two substances on the activity of protoplasma H^+-ATPase will be determined.

项目成果

島崎研一郎: "植物の光センシング"秀潤社. 192 (2001)

Kenichiro Shimazaki：“植物的光传感”Shujunsha 192（2001）。

T.Kinoshita and K.Shimazaki: "Analysis of the phosphorylation level in guard-cell plasma membrane H^+-ATPase in response to fusicoccin."Plant & Cell Physiology. 42(in press). (2001)

T.Kinoshita 和 K.Shimazaki：“分析保卫细胞质膜 H+-ATP 酶响应梭菌素的磷酸化水平。”植物

Takashi, Emi: "Specific binding of vf14-3-3a isoform to the plasma membrane H^+-ATPase in response to blue light and fusicoccin in guard cells of broad beans"Plant Physiology. 125. 1115-1125 (2001)

Takashi，Emi：“蚕豆保卫细胞中 vf14-3-3a 亚型与质膜 H2-ATP 酶响应蓝光和梭菌素的特异性结合”植物生理学。

Toshinori Kinoshita: "phot1 and phot2 mediate blue light regulation of stomatal opening"Nature. 414. 656-660 (2001)

Toshinori Kinoshita：“phot1和phot2介导气孔开放的蓝光调节”自然。

木下俊則,島崎研一郎: "青色光による気孔開口と細胞膜H^+-ATPase"化学と生物. 38. 774-776 (2000)

Toshinori Kinoshita、Kenichiro Shimazaki：“蓝光诱导气孔开放和细胞膜 H^+-ATPase”化学与生物学 38. 774-776 (2000)。