タンパク質の液胞輸送にかかわるプロテイナーゼ小胞の形成機構

参与蛋白质液泡运输的蛋白酶囊泡的形成机制

• 批准号: 12740441
• 负责人: 岡本 龍史
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12740441/
• 关键词: 小胞体; 液胞; プロテイナーゼ; KDEL配列; 細胞内輸送; 発芽種子; アラビドプシス; 老化

ケツルアズキ発芽子葉細胞においてde novo合成されるシステイン・プロテイナーゼ(SH-EP)は不活性な前駆体として小胞体先端部に集積し、プロテイナーゼ小胞により液胞に輸送される。このプロテイナーゼ小胞の形成機構の解明を目的として、SH-EPの全長およびC末端KDEL配列を欠失させたSH-EP(KDEL-)をシロイヌナズナで発現させた。SH-EP(KDEL+)を発現させたシロイヌナズナを免疫組織化学的手法により観察したところ、プロテイナーゼ小胞と同様の直径100-500nmの小胞にSH-EP(KDEL+)は高度に集積していた。一方、SH-EP(KDEL-)は細胞外に分泌され、細胞間隙の一部に集積していた。SH-EP(KDEL-)を発現するシロイヌナズナは種子(T1)発芽後、本葉を2-4枚出すまでは成長したが、その後枯死した。そこで活性中心アミノ酸のシステインをグリシンに置換したSH-EP(C152G, KDEL-)を発現する形質転換体を作成したところ、その植物体は正常に生育した。以上のことから、プロテイナーゼ小胞の形成にはC末端KDEL配列が必須であること、および、KDEL配列が液胞輸送シグナルとして機能している可能性が示された。また、細胞外に分泌されたSH-EP(KDEL-)により細胞壁の外側または細胞間隙に局在しているタンパク質が分解されたため植物体が枯死したことが推定された。プロテイナーゼ小胞を可視化するために、シグナルペプチド(SP)-GFP-SHEPおよびSP-DsRED-SHEPをそれぞれタバコ培養細胞で発現させたところ、プロテイナーゼ小胞に相当するスポット状のシグナルが観察され、さらに細胞分裂期には両融合タンパク質は小胞体と同様の細胞内分布を示した。これらは、プロテイナーゼ小胞が小胞体由来であることを支持した。

In the early stages of development, the cotyledon cells were transformed into protoplasts, and the protoplasts and protoplasts were transformed into protoplasts. The mechanism of cell formation in SH-EP was analyzed. The length and C-terminal KDEL of SH-EP(KDEL-) were determined. SH-EP(KDEL+) was detected by immunohistochemical methods. SH-EP(KDEL+) was highly concentrated in small cells with diameters of 100-500nm. One side, SH-EP(KDEL-) is secreted outside the cell, and part of the cell gap is accumulated. SH-EP(KDEL-) appears after germination of seeds (T1), and leaves grow and die after germination of 2-4. The active center of the plant was transformed into SH-EP(C152G, KDEL-). The above results show the possibility that the C-terminal KDEL alignment is necessary for the formation of small cells. The extracellular secretion of SH-EP(KDEL-) is presumed to be due to the breakdown of the plant in the cell wall. Cell visualization shows cell development in culture, cell morphology, cell division, cell fusion, and intracellular distribution of the same. The origin of small cells is called "".

项目成果

Takashi Okamoto, Kiminori Toyooka, Takao Minamikawa: "Identification of a membrane-associated cysteine protease with possible dual roles in the endoplasmic reticulum and protein storage vacuole"Journal of Biological Chemistry. 276,1. 742-751 (2001)

Takashi Okamoto、Kiminori Toyooka、Takao Minamikawa：“鉴定一种膜相关半胱氨酸蛋白酶，在内质网和蛋白质储存液泡中可能具有双重作用”《生物化学杂志》。

Masatoshi Taneyama: "Involvement of Gibberellins in Expression of a Cysteine Proteinase (SH-EP) in Cotyledons of Vigna mungo Seedlings"Plant Cell Physiol.. 42・11. 1290-1293 (2001)

田山正敏：“赤霉素参与绿豆幼苗子叶中半胱氨酸蛋白酶（SH-EP）的表达”《植物细胞生理学》.. 42・11（2001）。

Takashi Okamoto: "Identification of a membrane-associated cysteine protease (MCP) with possible dual roles in the endoplasmic reticulum and protein storage vacuole"J. Biol. Chem.. 276・1. 742-751 (2001)

冈本隆：“在内质网和蛋白质储存液泡中可能具有双重作用的膜相关半胱氨酸蛋白酶（MCP）的鉴定”J. Chem. 742-751（2001）。

岡本龍史: "KDEL小胞を介した液胞タンパク質の輸送系(植物細胞工学シリーズ17.)"秀潤社(印刷中). (2002)

Ryuji Okamoto：“通过 KDEL 囊泡的液泡蛋白质运输系统（植物细胞工程系列 17）”Shujunsha（出版中）。

Takao Minamikawa: "Degradation of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase by vacuolar enzymes of senescing French bean leaves : Immunocytochemical and ultrastructural observations"Protoplasma. 218. 144-153 (2001)

Takao Minamikawa：“衰老法国豆叶的液泡酶对核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的降解：免疫细胞化学和超微结构观察”原生质体。