分子生物学的手法による有機溶媒耐性プロテアーゼの作製

利用分子生物学方法生产耐有机溶剂蛋白酶

• 批准号: 12750705
• 负责人: 荻野 博康
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12750705/
• 关键词: 有機溶媒耐性酵素; プロテアーゼ; 有機溶媒耐性微生物; Pseudomonas aeruginosa

プロテアーゼはタンパク質を加水分解する酵素であるが、有機溶媒存在下では、ペプチドやエステルの合成反応を触媒することができる。しかしながら、一般に酵素は有機溶媒に不溶であり、しかも有機溶媒存在下では容易に変性、失活する。申請者らは、先に、有機溶媒に安定なプロテアーゼを産生する有機溶媒耐性微生物Pseudomonas aeruginosa PST-01株の取得に成功している。本研究では、P. aeruginosa PST-01株が産生する有機溶媒に安定なプロテアーゼの有機溶媒安定性を分子生物学的手法により解明することを目的とする。PST-01プロテアーゼとサーモライシンは共に活性中心に亜鉛イオンを有するメタルプロテアーゼであり、全体的な立体構造は非常によく似ている。有機溶媒に安定なPST-01プロテアーゼの分子内には2つのジスルフィド結合が存在するが、熱に安定なサーモライシンの分子内にはジスルフィド結合がない。そこで、酵素の有機溶媒安定性の一要因は分子内のジスルフィド結合の存在にあると考え、ジスルフィド結合が欠損した変異PST-01プロテアーゼを作製した。PST-01プロテアーゼの分子内に存在する2つのジスルフィド結合の内、270番目と297番目のシステイン間のジスルフィド結合が欠損するように作製した変異酵素遺伝子を有する大腸菌はプロテアーゼ活性を持たないことから、270番目と297番目のシステイン間のジスルフィド結合はPST-01プロテアーゼの活性発現に必須であることがわかった。これに対して、30番目と58番目のシステイン間のジスルフィド結合が欠損した変異酵素は、有機溶媒安定性が顕著に低下しており、30番目と58番目のシステイン間のジスルフィド結合はPST-01プロテアーゼの有機溶媒安定性に重要な役割を果たしていることがわかった。

プ ロ テ ア ー ゼ は タ ン パ ク qualitative を hydrolytic decomposition す る enzyme で あ る が, organic solvent in the presence of で は, ペ プ チ ド や エ ス テ ル の synthetic anti 応 を catalyst す る こ と が で き る. <s:1> ながら ながら, general に enzymes <s:1> organic solvents に are insoluble in であ, で で are prone to に deformation and inactivation する in the presence of <s:1> organic solvents. Applicants ら は, first に, organic solvent に settle な プ ロ テ ア ー ゼ を produce す る organic solvent tolerance microbial Pseudomonas aeruginosa PST - 01 strain の に success し て い る. This study で は, p. aeruginosa PST - 01 が strains produce す る organic solvent に settle な プ ロ テ ア ー ゼ の organic solvent stability を molecular biology technique に よ り interpret す る こ と を purpose と す る. PST - 01 プ ロ テ ア ー ゼ と サ ー モ ラ イ シ ン は に total active center に 亜 lead イ オ ン を have す る メ タ ル プ ロ テ ア ー ゼ で あ り, all な three-dimensional structure は very に よ く like て い る. Organic solvent に settle な PST - 01 プ ロ テ ア ー ゼ の intramolecular に は 2 つ の ジ ス ル フ ィ ド combining が exist す る が, hot に stable な サ ー モ ラ イ シ ン の intramolecular に は ジ ス ル フ ィ ド combining が な い. そ こ で の organic solvent, the enzyme stability の one by は intramolecular の ジ ス ル フ ィ ド combining の is に あ る と え test, ジ ス ル フ ィ ド combining が owe loss し た - different PST - 01 プ ロ テ ア ー ゼ を cropping し た. PST - 01 プ ロ テ ア ー ゼ の intramolecular に exist す る 2 つ の ジ ス ル フ ィ ド の inner, 270's yard と 297 times の シ ス テ イ ン between の ジ ス ル フ ィ ド combining が owe loss す る よ う に cropping し た - traces of isoenzymes 伝 son を す る coliform は プ ロ テ ア ー ゼ active を hold た な い こ と か ら, 270's yard と 297 times の シ Between ス テ イ ン の ジ ス ル フ ィ ド combining は PST - 01 プ ロ テ ア ー ゼ の active 発 に must now で あ る こ と が わ か っ た. こ れ に し seaborne て, 30 times yard と 58 times の シ ス テ イ ン between の ジ ス ル フ ィ ド combining が owe loss し た - isoenzymes は, organic solvent stability が 顕 with low に し て お り, 30 times yard と 58 times の シ ス テ イ ン between の ジ ス ル フ ィ ド combining は PST - 01 プ ロ テ ア ー ゼ の organic solvent stability に important な "を cut fruit た し て い る Youdaoplaceholder0 とがわ った.

项目成果

H.Ogino et al.: "Cloning and Sequencing of a Gene of Organic Solvent-Stable Protease Secreted from Pseudomonas aeruginosa PST-01 and Its Expression in Escherichia coli"Biochemical Engineering Journal. 5・3. 191-200 (2000)

H.Ogino 等：“铜绿假单胞菌 PST-01 分泌的有机溶剂稳定蛋白酶基因的克隆和测序及其在大肠杆菌中的表达”《生化工程杂志》191-200 (2000)。

H.Ogino et al.: "The Synthetic Rate of Dipeptide Catalyzed by Organic Solvent-Stable Protease from Pseudomonas aeruginosa PST-01 in the Presence of Water-Soluble Organic Solvents"Biochemical Engineering Journal. 5・3. 219-233 (2000)

H.Ogino等：“在水溶性有机溶剂存在下由铜绿假单胞菌PST-01的有机溶剂稳定蛋白酶催化的二肽的合成率”生物化学工程杂志5·3（2000）。

H.Ogino et al.: "Role of Intermolecular Disulfide Bonds of the Organic Solvent-Stable PST-01 Protease in the Organic Solvent-Stability"Applied and Environmental Microbiology. 67・2. 942-947 (2001)

H.Ogino 等人：“有机溶剂稳定的 PST-01 蛋白酶的分子间二硫键在有机溶剂稳定性中的作用”应用和环境微生物学 67・2（2001）。

H.Ogino and H.Ishikawa: "Enzymes Which are Stable in the Presence of Organic Solvents"Journal of Bioscience and Bioengineering. 91・2. 109-116 (2001)

H.Ogino 和 H.Ishikawa：“在有机溶剂存在下稳定的酶”《生物科学与生物工程杂志》91・2（2001 年）。