N-結合型糖鎖生合成初期に必要なヒトマンノース転移酵素群の解析

N-连接糖链生物合成早期所需的人甘露糖基转移酶分析

• 批准号: 12760066
• 负责人: 高橋 哲夫
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12760066/
• 关键词: N-結合型糖鎖; リピド中間体; マンノース転移酵素; cDNAクローニング; ゲノム解析

本研究は、N-結合型糖鎖生合成初期に必要な3種のマンノース転移酵素(MT-I,MT-III,MT-IV)をコードするヒト遺伝子の構造・機能を解析することを目的としている。本年度は、以下の1〜4を主として行った。1.ヒトMT-III及びMT-IV遺伝子のコード領域の解明ヒトMT-III遺伝子に関しては、完全長cDNAのクローニングに成功し、その全コード領域の構造決定を完了した。ヒトMT-IV遺伝子に関しては、当遺伝子を含むYACクローン923f5中の約1MbのヒトゲノムDNA断片をカバーするBACクローン群を用いてコンティグマップを作製した。現在、これらの整理された各BACクローンを用いてG258変異株の変異相補活性の検討を行い、遺伝子局在領域を限定している。2.ヒトMT遺伝子の転写調節領域の解明コード領域が確定したヒトMT-I遺伝子の上流0.2kb〜1.0kbのゲノムDNA領域に関して、現在CATアッセイを行い、転写調節に働いている領域を限定している。今後、ヒトMT-III遺伝子に関しても同様の解析を行う予定である。3.ヒトMT酵素の大量発現系の構築ヒトMT-I遺伝子を用いて3種のタグ(c-myc,FLAG,HA)を付加したコンストラクトを作製し、ヒトHeLa細胞に導入した。現在、得られた各タグ付加MT-I遺伝子の安定形質転換株について、各タグに対する抗体を用いてウェスタンプロット解析を行い、MT-I酵素の発現量を解析している。4.動物細胞におけるヒトMT発現抑制効果の解析マウスFM3A細胞にヒトMT-I遺伝子のアンチセンスDNAを導入し、得られた安定形質転換株を解析したが、明確な抑制効果が認められなかった。そこで、マウスMT-I遺伝子を新規にクローニングし、そのアンチセンスDNAをFM3A細胞に導入した。現在、その発現抑制効果を検討中である。

は, N - this study combined with early type sugar lock biosynthesis に necessary な three の マ ン ノ ー ス planning shift enzyme (MT - I, MT - III, MT - IV) を コ ー ド す る ヒ ト heritage 伝 son の structure, function analytical す を る こ と を purpose と し て い る. For the current year を, the following <s:1> 1-4 を main と て て った lines った. 1. ヒ ト び MT and MT - III - IV heritage 伝 son の コ ー ド field の interpret ヒ ト MT - III heritage 伝 son に masato し て は, full length cDNA の ク ロ ー ニ ン グ に successful し, そ の full コ ー の ド field structure decided to finished を し た. ヒ ト MT - IV heritage 伝 son に masato し て は, when but 伝 を containing む YAC ク ロ ー ン 923 f5 の about 1 MB の ヒ ト ゲ ノ ム DNA fragment を カ バ ー す る BAC ク ロ ー を ン group with い て コ ン テ ィ グ マ ッ プ を cropping し た. Now, こ れ ら の finishing さ れ た the BAC ク ロ ー ン を with い て G258 - different strains の - phase-out complement activity の 検 line for を い, but 伝 bureau in field を qualified し て い る. 2. ヒ ト MT heritage 伝 son の planning, regulating field の interpret コ ー ド field が determine し た ヒ ト MT - I chose 伝 son の high 0.2 KB of 1.0 KB の ゲ ノ ム DNA field に masato し て, now the CAT ア ッ セ イ を い, planning to write regulating に 働 い て い る field を qualified し て い る. In the future, ヒトMT-III will leave 伝 sub-に related to the same <s:1> analysis を line う set である. 3. ヒ ト MT enzyme の large 発 now is の build ヒ ト MT - I chose 伝 son を with い て three の タ グ (c - myc, FLAG, HA) を plus し た コ ン ス ト ラ ク ト を as し, ヒ ト HeLa に import し た. Now, have to ら れ た each タ グ plus MT - I chose 伝 son の stability character planning in plant に つ い て, various タ グ に す seaborne を る antibody with い て ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ ト parsing を い, MT -i enzyme の 発 now quantity を parsing し て い る. 4. Animal cells に お け る ヒ ト MT 発 now working fruit の マ analytical ウ ス FM3A cells に ヒ ト MT - I chose 伝 son の ア ン チ セ ン ス DNA を import し, ら れ た stable form quality planning in plant を parsing し た が, clear な inhibition of unseen fruit が め ら れ な か っ た. そ こ で, マ ウ ス MT - I chose 伝 son を new rules に ク ロ ー ニ ン グ し, そ の ア ン チ セ ン ス DNA を FM3A cells に import し た. Now, そ そ has an inhibitory effect を検 on である.

项目成果

増田 貴久: "マウスG258変異株のリピド中間体生合成変異を相補するヒト遺伝子のクローニング"生化学. 73巻・8号. 823 (2001)

Takahisa Masuda：“克隆小鼠 G258 突变体中的脂质中间体生物合成突变”，《生物化学》第 73 卷，第 8. 823 期（2001 年）。

Kensuke Kataoka: "Characterization of human mega YAC clone-transformants of a mouse FM3A mutant G258 cell line that is defective in lipid-linked oligosaccharide synthesis"Abstracts of the Second International Glycosyltransferase Symposium : Glycosyltransf

Kensuke Kataoka：“脂质连接寡糖合成缺陷的小鼠 FM3A 突变体 G258 细胞系的人大型 YAC 克隆转化体的表征”第二届国际糖基转移酶研讨会摘要：糖基转移

高橋哲夫: "アスパラギン結合型糖鎖の五糖コア構造形成に働く2種のマンノース転移酵素をコードするヒト遺伝子のゲノム解析"生化学. 72巻・8号. 857 (2000)

Tetsuo Takahashi：“对编码两种类型的甘露糖基转移酶的人类基因进行基因组分析，这些甘露糖基转移酶在形成天冬酰胺连接的糖链的五糖核心结构中发挥作用”，《生物化学》第 72 卷，第 8.857 期（2000 年）。

増田 貴久: "マウスリピド中間体生合成変異株G258の変異に相補的なヒトゲノム領域の近傍を含むBACクローンのスクリーニング"日本農芸化学会誌. 75巻・臨時増刊号. 135 (2001)

Takahisa Masuda：“筛选含有与小鼠脂质中间生物合成突变株G258突变互补的人类基因组区域附近的BAC克隆”，日本农业化学学会杂志，第75卷，特刊（2001年）。

土田洋平: "マウス・リピド中間体生合成変異株G258の変異に相補的なヒトゲノム領域を含むコスミドのスクリーニング"日本農芸化学会誌. 74巻・臨時増刊号. 381 (2000)

Yohei Tsuchida：“筛选含有与小鼠脂质中间生物合成突变株 G258 突变互补的粘粒”，日本农业化学学会杂志，第 74 卷，特刊（2000 年）。