アスパラギン結合型糖鎖生合成に関連するヒト新規糖転移酵素遺伝子の単離の試み

尝试分离与天冬酰胺连接的糖链生物合成相关的新型人类糖基转移酶基因

• 批准号: 07760097
• 负责人: 高橋 哲夫
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760097/
• 关键词: アスパラギン結合型糖鎖; リピド中間体; 糖転移酵素

本研究は、ホモロジー・クローニング法と、発現クローニング法の2つのアプローチにより、リピド中間体生合成過程で働く新規のヒト糖転移酵素遺伝子を単離することを目的とした。ホモロジー・クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、酵母においてリピド中間体生合成過程に働くマンノース転移酵素の遺伝子であるALG2を利用することにした。まず酵母ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより全長約1.9kbのALG2遺伝子をクローニングし、これをプローブとして、2種類のヒト肝臓cDNAライブラリーの検索を行った。2.6×10^5クローンを検索した結果、最終的に6クローンを単離した。そのうちの3クローンについて塩基配列を解析したところ、それぞれUDP-glucronosyltransferase、Gastrin binding protein、Mitochondrial enoyl-CoAHydrataseの遺伝子の一部であることが判明した。現在、残りの3クローンについて塩基配列決定を行っており、終了次第、翻訳領域の検索、遺伝子データベースの検索を行う予定である。発現クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、X線照射したヒトHeLa細胞とG258変異株を細胞融合し、温度感受性からの回復を指標に第1次形質転換株を3株単離した(XR-2,-6,-8,株)。これらXRクローンについてAlu PCRを行ない、ヒト染色体断片の存在を確認するとともに、[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認した。次にXRクローンにおける目的遺伝子を含むヒト染色体領域をさらに限定するため、XR-6株にX線を照射しG258変異株と融合して第2次形質転換株を5株単離した(WXR-6-2,-7,-9,-10,-12株)。これらWXRクローンについて[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認するとともに、Alu PCRを行なったところ、約1.3kbの増幅ヒトDNA断片が共通に検出された。現在、この共通断片をクローニングし塩基配列を決定している。今後、このヒトDNA断片をマーカーとして、YACライブラリーを検索し目的遺伝子の単離を試みる予定である。

は, this study ホ モ ロ ジ ー · ク ロ ー ニ ン グ と, 発 now ク ロ ー ニ ン グ の 2 つ の ア プ ロ ー チ に よ り, リ ピ ド intermediates biosynthesis process で 働 く new rules の ヒ ト sugar heritage planning shift enzyme 伝 son を 単 from す る こ と を purpose と し た. ホ モ ロ ジ ー · ク ロ ー ニ ン グ method に よ る purpose heritage 伝 son の 単 from に masato し て は, yeast に お い て リ ピ ド intermediates biosynthesis process に 働 く マ ン ノ ー ス planning shift enzyme の heritage 伝 son で あ る ALG2 を using す る こ と に し た. ま ず yeast ゲ ノ ム DNA を type where と し た PCR に よ り stretches approximately 1.9 KB の ALG2 posthumous son 伝 を ク ロ ー ニ ン グ し, こ れ を プ ロ ー ブ と し て, 2 species の ヒ ト routine liver cDNA ラ イ ブ ラ リ ー の 検 cable line を っ た. 2.6×10^5 ロ ロ を検 を検 を検 を検 を検 search the た result, the final に6 ロ ロ を単 を単 を単 を単 た た た. そ の う ち の 3 ク ロ ー ン に つ い て salt base with column を parsing し た と こ ろ, そ れ ぞ れ UDP - glucronosyltransferase, Gastrin binding protein, Mitochondrial The heritage of enoyl-CoAHydratase 伝 sub-で ある とが とが judgment た. Now, the residual り の 3 ク ロ ー ン に つ い て salt base line arrangement decided を っ て お り, at the end of time, turn 訳 の 検 rope, but 伝 デ ー タ ベ ー ス の 検 cable line を う designated で あ る. 発 now ク ロ ー ニ ン グ method に よ る purpose heritage 伝 son の 単 from に masato し て は, X-ray irradiation し た ヒ ト HeLa と G258 - different plant cell fusion し を, temperature sensibility か ら の reply を index に first form quality planning in seedlings 単 を 3 from し た (XR - 2-6-8, strain). こ れ ら XR ク ロ ー ン に つ い て Alu PCR line を な い, ヒ ト chromosome fragment の exist を confirm す る と と も に, 2 - ^ 3 h] [マ ン ノ ー ス の take り 込 み be 験 に よ り, リ ピ ド intermediates biosynthesis - different か ら の complex 帰 を confirm し た. Time に XR ク ロ ー ン に お け る purpose heritage 伝 son を containing む ヒ ト genomics を さ ら に qualified す る た め, XR - 6 strains に X-ray を irradiation し G258 - different strains と fusion し て second form quality planning in seedlings 単 を 5 from し た (WXR - 6-2, 7, 9, 10, and 12 strains). こ れ ら WXR ク ロ ー ン に つ い て [2] - ^ 3 h マ ン ノ ー ス の take り 込 み be 験 に よ り, リ ピ ド intermediates biosynthesis - different か ら の complex 帰 を confirm す る と と も に, Alu PCR を な っ た と こ ろ, about 1.3 KB の raised ヒ ト DNA fragment が common に 検 out さ れ た. Now, the common fragment を, ロ, ロ, ニ, グ, the arrangement of the <s:1> salt base を determines the <s:1>, て, る and る. In the future, こ の ヒ ト DNA fragment を マ ー カ ー と し て, YAC ラ イ ブ ラ リ ー を 検 cable し purpose heritage 伝 son の 単 from を try み る designated で あ る.

项目成果

竹下 壱: "Radiation Hybrid法によるマウスFM3A細胞由来G258株のリピド中間体生合成変異に相補的なヒト染色体断片の導入" 生化学. 67. 921- (1995)

Ichi Takeshita：“通过辐射杂交方法在小鼠 FM3A 细胞衍生的 G258 菌株中引入与脂质中间生物合成突变互补的人类染色体片段”生物化学 67. 921- (1995)。

高橋 哲夫: "マウスFM3A細胞由来G258株のリピド中間体生合成変異に関する温度感受性変異に相補的なヒト遺伝子分離" 第8回東工大糖鎖研究会 研究発表要旨. (1995)

Tetsuo Takahashi：“与小鼠 FM3A 细胞衍生的 G258 菌株中脂质中间生物合成突变相关的温度敏感突变的互补人类基因的分离”第 8 届东京技术聚糖研究会议研究报告摘要（1995 年）。

竹下 壱: "Radiation Hybrid法によるマウスFM3A細胞由来G258株のリピド中間体生合成変異に相補的なヒト染色体断片の導入" 第5回ドリコールおよびイソプレノイド研究会講演要旨集. 16- (1995)

Ichi Takeshita：“使用辐射杂交方法在小鼠 FM3A 细胞衍生菌株 G258 中引入与脂质中间生物合成突变互补的人类染色体片段”第 5 届 Dolichol 和类异戊二烯研究组摘要 16- (1995)。

竹下 壱: "マウスFM3A細胞由来G258変異株のリピド中間体生合成変異に相補的なヒトDNAのクローニング" 日本農芸化学会会誌(臨時増刊). 69. 294- (1995)

Ichi Takeshita：“与小鼠FM3A细胞衍生的G258突变体的脂质中间生物合成突变互补的人类DNA的克隆”日本农业化学学会杂志（特别版）69。294-（1995）。

高橋 哲夫: "マウスFM3A細胞由来G258変異株のリピド中間体生合成変異を相補するヒト染色体断片の解析" 日本農芸化学会会誌(臨時増刊). 70. 317- (1996)

Tetsuo Takahashi：“对源自小鼠 FM3A 细胞的 G258 突变体中脂质中间生物合成突变进行补充的人类染色体片段的分析”日本农业化学学会杂志（特刊）70. 317-（1996）。