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アスパラギン結合型糖鎖生合成に関連するヒト新規糖転移酵素遺伝子の単離の試み

尝试分离与天冬酰胺连接的糖链生物合成相关的新型人类糖基转移酶基因

基本信息

批准号：
07760097
负责人：
高橋哲夫
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tokai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760097/
关键词：
アスパラギン結合型糖鎖リピド中間体糖転移酵素

项目摘要

本研究は、ホモロジー・クローニング法と、発現クローニング法の2つのアプローチにより、リピド中間体生合成過程で働く新規のヒト糖転移酵素遺伝子を単離することを目的とした。ホモロジー・クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、酵母においてリピド中間体生合成過程に働くマンノース転移酵素の遺伝子であるALG2を利用することにした。まず酵母ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより全長約1.9kbのALG2遺伝子をクローニングし、これをプローブとして、2種類のヒト肝臓cDNAライブラリーの検索を行った。2.6×10^5クローンを検索した結果、最終的に6クローンを単離した。そのうちの3クローンについて塩基配列を解析したところ、それぞれUDP-glucronosyltransferase、Gastrin binding protein、Mitochondrial enoyl-CoAHydrataseの遺伝子の一部であることが判明した。現在、残りの3クローンについて塩基配列決定を行っており、終了次第、翻訳領域の検索、遺伝子データベースの検索を行う予定である。発現クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、X線照射したヒトHeLa細胞とG258変異株を細胞融合し、温度感受性からの回復を指標に第1次形質転換株を3株単離した(XR-2,-6,-8,株)。これらXRクローンについてAlu PCRを行ない、ヒト染色体断片の存在を確認するとともに、[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認した。次にXRクローンにおける目的遺伝子を含むヒト染色体領域をさらに限定するため、XR-6株にX線を照射しG258変異株と融合して第2次形質転換株を5株単離した(WXR-6-2,-7,-9,-10,-12株)。これらWXRクローンについて[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認するとともに、Alu PCRを行なったところ、約1.3kbの増幅ヒトDNA断片が共通に検出された。現在、この共通断片をクローニングし塩基配列を決定している。今後、このヒトDNA断片をマーカーとして、YACライブラリーを検索し目的遺伝子の単離を試みる予定である。

This study aims to develop a new method for the isolation of sugar transfer enzyme genes in the intermediate biosynthesis process. In the process of intermediate biosynthesis, ALG2 is utilized in the process of enzyme transfer. The yeast DNA sequence was amplified by PCR and the ALG2 gene sequence of about 1.9 kb was amplified by PCR. 2.6×10^5 search results, final 6 search results A part of UDP-glucronosyltransferase, Gastrin binding protein, Mitochondrial enoyl-CoAHydrotase gene was identified. Now, the residue of the three sets of base allocation decision to conduct the test, the final order, the search of the field, the search of the child to conduct the predetermined test. The isolation of target strains was detected by X-ray irradiation, cell fusion of HeLa cells and G258 mutants, temperature sensitivity and recovery index, and 3 isolated strains (XR-2,-6,-8, strains) were isolated for the first time. Alu PCR was performed in the XR database, and the presence of chromosome fragments was confirmed.[2-^3H] was detected in the database, and the synthesis of intermediates was confirmed. XR-6 strain was irradiated with X-ray, G258 mutant was fused, and 5 mutant strains were isolated from the second mutant strain (WXR-6-2,-7,-9,-10,-12 strains). For example, WXR can be used to detect [2-^3H] DNA fragments, which can be amplified by PCR. Now, the common fragment is determined. In the future, the DNA fragment will be separated from the target DNA fragment.