アスパラギン結合型糖鎖生合成に関連するヒト新規糖転移酵素遺伝子の単離の試み

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本研究は、ホモロジー・クローニング法と、発現クローニング法の2つのアプローチにより、リピド中間体生合成過程で働く新規のヒト糖転移酵素遺伝子を単離することを目的とした。ホモロジー・クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、酵母においてリピド中間体生合成過程に働くマンノース転移酵素の遺伝子であるALG2を利用することにした。まず酵母ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより全長約1.9kbのALG2遺伝子をクローニングし、これをプローブとして、2種類のヒト肝臓cDNAライブラリーの検索を行った。2.6×10^5クローンを検索した結果、最終的に6クローンを単離した。そのうちの3クローンについて塩基配列を解析したところ、それぞれUDP-glucronosyltransferase、Gastrin binding protein、Mitochondrial enoyl-CoAHydrataseの遺伝子の一部であることが判明した。現在、残りの3クローンについて塩基配列決定を行っており、終了次第、翻訳領域の検索、遺伝子データベースの検索を行う予定である。発現クローニング法による目的遺伝子の単離に関しては、X線照射したヒトHeLa細胞とG258変異株を細胞融合し、温度感受性からの回復を指標に第1次形質転換株を3株単離した(XR-2,-6,-8,株)。これらXRクローンについてAlu PCRを行ない、ヒト染色体断片の存在を確認するとともに、[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認した。次にXRクローンにおける目的遺伝子を含むヒト染色体領域をさらに限定するため、XR-6株にX線を照射しG258変異株と融合して第2次形質転換株を5株単離した(WXR-6-2,-7,-9,-10,-12株)。これらWXRクローンについて[2-^3H]マンノースの取り込み実験により、リピド中間体生合成変異からの復帰を確認するとともに、Alu PCRを行なったところ、約1.3kbの増幅ヒトDNA断片が共通に検出された。現在、この共通断片をクローニングし塩基配列を決定している。今後、このヒトDNA断片をマーカーとして、YACライブラリーを検索し目的遺伝子の単離を試みる予定である。