視細胞外節に対するエネルギー供給機構のin situ及び免疫細胞化学的解明

原位和免疫细胞化学阐明光感受器外节的能量供应机制

• 批准号: 12770004
• 负责人: 西沢 祐治
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770004/
• 关键词: クレアチンキナーゼ; 視細胞; ミトコンドリア; 免疫細胞化学; ATP; クレアチンリン酸シャトル機構; クレアチンリン酸

視細胞のクレアチンリン酸シャトル機構を明らかにするために,ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(Mi-CK)に対する抗体を作製し,免疫細胞化学によって視細胞におけるクレアチンキナーゼの分布を検討した.ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(Mi-CK)に対する抗体を作製するために,視細胞の全タンパク質を2次元電気泳動によって分離し,Mi-CKのタンパク質スポットを質量分析装置によって同定した.このスポットに含まれるタンパク質をPVDF膜に転写後,N末端配列をプロテインシークエンスして, cDNAから予測される配列と比較したところ,Mi-CKのミトコンドリアヘの移行シグナル(シグナルシークェンス)の存在が明らかになった.成熟タンパク質のN末端配列は脳型クレアチンキナーゼ(B-CK)や筋型クレアチンキナーゼ(M-CK)と全く異なっていたので,この部分の14アミノ酸配列(ASERRRLYPPSAEY)を抗原としてウサギ2羽に免疫した.現在免疫作業続行中であるが,抗体価測定のために中途採血した血液から作製した血清を用いて免疫細胞化学を行ったところ,作製したMi-CKに対する抗血清は視細胞のミトコンドリアをラベルし,バックグランドは比較的低かった.これによりプレリミテリーな結果であるが,視細胞のMi-CKはミトコンドリアのみに存在することがほぼ明らかになった.このことは視細胞のミトコンドリアと内接との間のクレアチンリン酸シャトル機構の成立を示唆し,さらに前年度に明らかにした外節・内接間のクレアチンリン酸シャトル機構の存在を支持するものである.

Visual cell の ク レ ア チ ン リ ン acid シ ャ ト ル institutions を Ming ら か に す る た め に, ミ ト コ ン ド リ ア type ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ (Mi - CK) に す seaborne る し the antibody を cropping systems, immunocytochemistry に よ っ て visual cell に お け る ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ の distribution を beg し 検 た. ミ ト コ ン ド リ ア type ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ (Mi - CK) に す seaborne る antibody を cropping す る た め に, depending on the cell の full タ ン パ ク を (2 dimensional electric 気 swimming に よ っ て separation し, Mi - CK の タ ン パ ク qualitative ス ポ ッ ト を quality analysis device に よ っ て with fixed し た. こ の ス ポ ッ ト に containing ま れ る タ ン パ ク qualitative を PVDF membrane に planning after writing, N terminal with column を プ ロ テ イ ン シ ー ク エ ン ス し て, cDNA か ら be さ れ る match column と compare し た と こ ろ, Mi - CK の ミ ト コ ン ド リ ア ヘ の transitional シ グ ナ ル (シ グ ナ ル シ ー ク ェ ン ス) exist の が Ming ら か に な っ た. Mature タ ン パ ク qualitative は の N terminal with column type 脳 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ (B - CK) や reinforcement type ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ (M - CK) と く all different な っ て い た の で, こ の part の 14 ア ミ ノ acid with column (ASERRRLYPPSAEY) を antigen と し て ウ サ ギ 2 feather に immune し た. Immune the homework now 続 line で あ る が, determination of antibody 価 の た め に midway blood し た blood か ら cropping し た serum を い line chemical を っ て immune cells た と こ ろ, cropping し た Mi - CK に す seaborne る antiserum は visual cell の ミ ト コ ン ド リ ア を ラ ベ ル し, バ ッ ク グ ラ ン ド は compared low か っ た. こ れ に よ り プ レ リ ミ テ リ ー な Results で あ る が, depending on the cells の Mi - CK は ミ ト コ ン ド リ ア の み に exist す る こ と が ほ ぼ Ming ら か に な っ た. こ の こ と は visual cell の ミ ト コ ン ド リ ア と inscribed と の between の ク レ ア チ ン リ ン acid シ ャ ト ル institutions established の を business し, さ ら に before annual に Ming ら か に し た outer segment, inscribed between の ク レ ア チ ン リ ン acid シ ャ ト The を institution <e:1> has を support for する する である である である.

项目成果

Usukura,J.,Nishizawa,Y.,Shimomura,A.,Kobayashi,K.,Nagatsu,T.& Hagiwara,M.: "Direct imaging of phosphorylation-dependent conformational change and DNA binding of CREB by electron microscopy"Genes to Cells. 5. 515-522 (2000)

薄仓 J.、西泽 Y.、下村 A.、小林 K.、永津 T.

Nishizawa, Y., Usukura, J., Singh, DP., Chylack, LT., SHINOHARA, T.: "Spatial and Temporal dynamics of twq alternatively spliced regulatory factors, lens epithelium-derived growth factor (ledgf/p75) and p52, in the nucleus"Cell Tissue and Research. 305. 1

Nishizawa, Y.、Usukura, J.、Singh, DP.、Chylack, LT.、SHINOHARA, T.：“twq 选择性剪接调节因子、晶状体上皮衍生生长因子 (ledgf/p75) 和 p52 的时空动态

Wakabayashi,T.,Teranishi,M.,Karbowski,M.,Nishizawa,Y.,Usukura,J.,Kurono,C & Soji,T.: "Functional aspects of megamitochondria isolated from hydrazine-and ethanol-treated rat livers"Pathology International. 50. 20-23 (2000)

若林 T.、寺西 M.、卡博斯基 M.、西泽 Y.、薄仓 J.、黑野 C