網膜視細胞におけるトポイソメラーゼIIβの生理、病理学的役割の検証

本研究の目的は、小型硬骨魚類メダカの桿体視細胞（桿体）を解析モデルに、成熟期以降の視細胞および網膜視機能におけるトポイソメラーゼIIβ（TopoIIβ）が果たす役割を明らかにし、網膜変性疾患の発症やその病態への関与の可能性を検証することである。令和３年度は終末分化後の任意のタイミングで（成熟期、老齢期）桿体限定的に TopoIIβ遺伝子の機能阻害を起こすトランスジェニックメダカ系統の作出を行った。初めに抗生物質テトラサイクリン系のドキシサイクリン（Dox）を添加・除去することでメダカ桿体特異的に任意のタイミングで導入遺伝子の発現をON/OFF制御できる新規テトラサイクリン遺伝子発現調節システム（newTet-ON）を開発した（論文、学会で発表）。続いて、newTet-ONシステムとCRISPR/Cas9 nuclease（Cas9）システムを用いてトランスジェニックメダカ２系統：Tg(U6-TopoIIβ-gRNA) (RNA pol III系プロモーター制御下に全身性にゲノム上のTopoIIβ遺伝子の特定DNA配列を標的とするガイドRNAを発現する系統) とTg(Rho-Cas9) (ロドプシンプロモーター(Rho)制御下で薬剤添加時に桿体特異的にCas9を発現する系統) の作出後、これら2系統の交配によりTopoIIβ遺伝子の機能解析の為のコンディショナルノックアウト系統 Tg(U6-TopoIIβ-gRNA; Rho-Cas9) を作出した。令和４年度は、時期・細胞種特異的なTopoIIβ遺伝子の完全破壊を達成するために、newTet-ONシステムとCre recombinase (Cre)/loxP部位特異的DNA組換えシステムを併用した新たなコンディショナルノックアウトメダカ系統（TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre）の追加作出を実施した。

本研究の目的は、小型硬骨魚類メダカの桿体視細胞（桿体）を解析モデルに、成熟期以降の視細胞および網膜視機能におけるトポイソメラーゼIIβ（TopoIIβ）が果たす役割を明らかにし、網膜変性疾患の発症やその病態への関与の可能性を検証することである。令和３年度は終末分化後の任意のタイミングで（成熟期、老齢期）桿体限定的に TopoIIβ遺伝子の機能阻害を起こすトランスジェニックメダカ系統の作出を行った。初めに抗生物質テトラサイクリン系のドキシサイクリン（Dox）を添加・除去することでメダカ桿体特異的に任意のタイミングで導入遺伝子の発現をON/OFF制御できる新規テトラサイクリン遺伝子発現調節システム（newTet-ON）を開発した（論文、学会で発表）。続いて、newTet-ONシステムとCRISPR/Cas9 nuclease（Cas9）システムを用いてトランスジェニックメダカ２系統：Tg(U6-TopoIIβ-gRNA) (RNA pol III系プロモーター制御下に全身性にゲノム上のTopoIIβ遺伝子の特定DNA配列を標的とするガイドRNAを発現する系統) とTg(Rho-Cas9) (ロドプシンプロモーター(Rho)制御下で薬剤添加時に桿体特異的にCas9を発現する系統) の作出後、これら2系統の交配によりTopoIIβ遺伝子の機能解析の為のコンディショナルノックアウト系統 Tg(U6-TopoIIβ-gRNA; Rho-Cas9) を作出した。令和４年度は、時期・細胞種特異的なTopoIIβ遺伝子の完全破壊を達成するために、newTet-ONシステムとCre recombinase (Cre)/loxP部位特異的DNA組換えシステムを併用した新たなコンディショナルノックアウトメダカ系統（TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre）の追加作出を実施した。