網膜視細胞におけるトポイソメラーゼIIβの生理、病理学的役割の検証

拓扑异构酶IIβ在视网膜感光细胞中生理和病理作用的验证

• 批准号: 21K09721
• 负责人: 細谷 修
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09721/
• 关键词: トポイソメラーゼIIβ; 網膜; 視細胞; メダカ; Tet-ON; CRISPR/Cas9; Cre/loxP; 網膜疾患; 網膜変性疾患

本研究の目的は、小型硬骨魚類メダカの桿体視細胞（桿体）を解析モデルに、成熟期以降の視細胞および網膜視機能におけるトポイソメラーゼIIβ（TopoIIβ）が果たす役割を明らかにし、網膜変性疾患の発症やその病態への関与の可能性を検証することである。令和３年度は終末分化後の任意のタイミングで（成熟期、老齢期）桿体限定的に TopoIIβ遺伝子の機能阻害を起こすトランスジェニックメダカ系統の作出を行った。初めに抗生物質テトラサイクリン系のドキシサイクリン（Dox）を添加・除去することでメダカ桿体特異的に任意のタイミングで導入遺伝子の発現をON/OFF制御できる新規テトラサイクリン遺伝子発現調節システム（newTet-ON）を開発した（論文、学会で発表）。続いて、newTet-ONシステムとCRISPR/Cas9 nuclease（Cas9）システムを用いてトランスジェニックメダカ２系統：Tg(U6-TopoIIβ-gRNA) (RNA pol III系プロモーター制御下に全身性にゲノム上のTopoIIβ遺伝子の特定DNA配列を標的とするガイドRNAを発現する系統) とTg(Rho-Cas9) (ロドプシンプロモーター(Rho)制御下で薬剤添加時に桿体特異的にCas9を発現する系統) の作出後、これら2系統の交配によりTopoIIβ遺伝子の機能解析の為のコンディショナルノックアウト系統 Tg(U6-TopoIIβ-gRNA; Rho-Cas9) を作出した。令和４年度は、時期・細胞種特異的なTopoIIβ遺伝子の完全破壊を達成するために、newTet-ONシステムとCre recombinase (Cre)/loxP部位特異的DNA組換えシステムを併用した新たなコンディショナルノックアウトメダカ系統（TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre）の追加作出を実施した。

The purpose of this study was to investigate the relationship between the development of retinal diseases and the possibility of retinal diseases in small teleost fish, including the analysis of rod optic cells (rods), the development of mature retinal optic cells and retinal visual function. In the third year, the function of TopoIIβ gene was inhibited by any stage after terminal differentiation (mature stage and old stage). The new regulation system for the generation of introduced genes was developed by adding and removing new antibiotics to and from the gene system (Dox) and by turning ON/OFF the new regulation system (newTet-ON) for the generation of introduced genes. CRISPR/Cas9 nucleotide (Cas9) system: Tg (U6-TopoIIβ-gRNA)(RNA pol III is a system for the generation of specific DNA alignment targets for TopoII beta genes in the genome) and Tg After the development of Rho-Cas9 (a rod-specific Cas9 generation system under the control of Rho), the functional analysis of the TopoII beta gene in the mating system of Rho 2 was developed as Tg(U6-TopoII beta-gRNA; Rho-Cas9). In order to complete the complete disruption of TopoIIβ gene in year 4, new Tet-ON system and Cre recombinase (Cre)/loxP site-specific DNA recombination system (TopoIIβflox/flox; Tg.Rho-Cre) were added.

项目成果

メダカDNAトポイソメラーゼIIβによる神経系の遺伝子発現制御

青鳉DNA拓扑异构酶IIβ对神经系统基因表达的调节

• 发表时间: 2021
• 作者: Liu Shihui;Matsuo Toshihiko;Miyaji Mary;Hosoya Osamu;金子 真也;原 雄一郎;宮地 まり，河野 真二，細谷 修，竹内 秀明，筒井 公子，筒井 研
• 通讯作者: 宮地 まり，河野 真二，細谷 修，竹内 秀明，筒井 公子，筒井 研

A modified Tet-ON system minimizing leaky expression for cell-type specific gene induction in medaka fish

• DOI: 10.1111/dgd.12743
• 发表时间: 2021-08-26
• 期刊: DEVELOPMENT GROWTH & DIFFERENTIATION
• 影响因子: 2.5
• 作者: Hosoya, Osamu;Chung, Myung;Miyaji, Mary
• 通讯作者: Miyaji, Mary

改良型Tet-ONシステムを用いたメダカ網膜特異的な遺伝子発現誘導

使用改进的 Tet-ON 系统诱导青鳉视网膜特异性基因表达

• 发表时间: 2021
• 作者: 細谷修;Myung Chung;安齋賢;竹内秀明;宮地まり
• 通讯作者: 宮地まり