破骨細胞分化制御因子の統合的解析-RANK/NFkBとc-fosとの相互作用-

1.ヒト前骨髄球性白血病細胞株であるHL-60を活性型ビタミンDおよびTPAで刺激することにより破骨細胞/マクロファージ系への分化を誘導すると、RANK mRNAの発現が著明に誘導された。2.上記のRANK発現誘導は機能的なRANKタンパクの細胞膜への発現を伴うことがMBP-RANKLを用いたin vitro結合アッセイにより確認された。3.この分化誘導刺激の際、gel shift assayでみたAP-1結合能の活性化がRANKの発現にやや先立って起こった。4.上記のAP-1の活性化はc-fosの発現そのものの上昇をも伴っていた。5.上記の如くRANKの発現を誘導したHL-60細胞をRANKLで刺激すると、AP-1およびNF-kB活性が上昇することがgel shift assayにより確認された。6.分化誘導によりRANKを発現したHL60-細胞をRANKLで刺激するとRANK自身の発現がmRNAおよびタンパクレベルで増加した。7.c-fos遺伝子ノックアウトマウスの脾細胞をM-CSF存在下で培養すると、RANK陽性の破骨細胞前駆細胞が得られた。これをRANKLで刺激すると程度は弱いものの、AP-1、NF-kBの活性化が認められた。以上の検討により、c-fosはRANKの発現そのものやRANKによるAP-1,NF-kBの活性化には必須でないことが明らかとなった。また、RANKLがRANK自身の発現を誘導するpositive feedbackにより破骨細胞分化が進行していく可能性が示された。RANKLの直接の標的遺伝子は他には知られておらず、RANKプロモーターはRANKLシグナルおよびこれにおけるc-fosの特異性を解析する有力なtoolとなり得るものと考えられた。

1.ヒト前骨髄球性白血病細胞株であるHL-60を活性型ビタミンDおよびTPAで刺激することにより破骨細胞/マクロファージ系への分化を誘導すると、RANK mRNAの発現が著明に誘導された。2.上記のRANK発現誘導は機能的なRANKタンパクの細胞膜への発現を伴うことがMBP-RANKLを用いたin vitro結合アッセイにより確認された。3.この分化誘導刺激の際、gel shift assayでみたAP-1結合能の活性化がRANKの発現にやや先立って起こった。4.上記のAP-1の活性化はc-fosの発現そのものの上昇をも伴っていた。5.上記の如くRANKの発現を誘導したHL-60細胞をRANKLで刺激すると、AP-1およびNF-kB活性が上昇することがgel shift assayにより確認された。6.分化誘導によりRANKを発現したHL60-細胞をRANKLで刺激するとRANK自身の発現がmRNAおよびタンパクレベルで増加した。7.c-fos遺伝子ノックアウトマウスの脾細胞をM-CSF存在下で培養すると、RANK陽性の破骨細胞前駆細胞が得られた。これをRANKLで刺激すると程度は弱いものの、AP-1、NF-kBの活性化が認められた。以上の検討により、c-fosはRANKの発現そのものやRANKによるAP-1,NF-kBの活性化には必須でないことが明らかとなった。また、RANKLがRANK自身の発現を誘導するpositive feedbackにより破骨細胞分化が進行していく可能性が示された。RANKLの直接の標的遺伝子は他には知られておらず、RANKプロモーターはRANKLシグナルおよびこれにおけるc-fosの特異性を解析する有力なtoolとなり得るものと考えられた。