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分子進化工学を用いた環境調和型水素生産システムの開発

利用分子进化工程开发环保制氢系统

基本信息

批准号：
12780417
负责人：
矢野和義
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780417/
关键词：
水素ヒドロゲナーゼ hypF 大腸菌 GST ICP

项目摘要

水素産生に関わる調節因子HypFについて分子進化工学を行うためには、まず本蛋白質の高発現系を確立する必要がある。このためHypFをグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)と融合した形で発現させる系を構築することにした。インサートDNAは、PCRにより作製した。鋳型のDNAとしては、hypFを含む約15kbpの大腸菌ゲノム断片がクローニングされているpEH1を用いた。PCRにより増幅されたインサートDNAは、電気泳動的に精製し後、プラスミドDNA(pGEX-6P-2)にライゲーションし、大腸菌JM109を形質転換した。目的のコンストラクトを持つと思われるプラスミドDNAを用いて、発現用宿主大腸菌BL21を形質転換した。IPTGの添加により融合蛋白質の発現を誘導した。培養液を集菌し、PBSに懸濁後、超音波で破砕した。Triton X-100の存在下で遠心し、回収した上清を2mlのGlutathion Sepharose 4Bを充填したカラムに通し、HypFとGSTの融合蛋白質をカラムに固定した。洗浄後、PreScission Proteaseを入れ、5℃で4時間反応させた。その後、カラムからHypFを回収した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、HypFとGSTの融合蛋白質(107kDa)、及び精製したHypF(81kDa)のバンドを確認することができた。HypFとGSTの融合蛋白質をGlutathion Sepharose 4BカラムにかけることによりHypFの固定化を行った。これを種々の金属と相互作用させることによって、HypFに配位する可能性のある金属を探索した。金属を配位したHypFを回収し、ICP原子発光分光分析法により配位金属の同定を行った。その結果、金属サンプルとして用いたニッケル、鉄、マグネシウム、亜鉛、銅のなかで、ニッケルが配位していることが示唆された。

The water quality factor HypF is very important for the chemical engineering. This is the most important part of the system. Do you want to know that you have a problem? HypF? Please DNA, PCR please make a mistake. Type DNA and hypF contain about 15kbp. The fragments are broken and the pEH1 is used. PCR was used to test DNA, electrophoretic exercise was used to detect DNA, pGEX-6P-2 was used to detect DNA, and JM109 was used to detect bacteria. Objective to evaluate the efficacy of DNA in the treatment of major bacteria (BL21). The fusion protein was added to IPTG so that the recombinant protein could be used to generate the recombinant protein. The culture liquid was used to collect bacteria and PBS, and ultrasound was used to break the bacteria. Triton Xmur100 contains the lower heart, the supernatant of 2ml, Glutathion Sepharose 4B, the fused protein of HypF, GST, the fusion protein, and the fixed protein. After washing, PreScission Protease was put in, and the temperature was 5 ℃ and 4 hours. After that, please tell HypF to go back to the hotel. SDS, HypF GST fusion protein (107kDa), and precision HypF (81kDa) fusion protein were tested by electrophoretic mobility shift assay (EIA) and electrophoretic assay (81kDa). HypF, GST, fusion protein, Glutathion Sepharose 4B, HypF, immobilization, immobilization and immobilization. The interaction of several kinds of metals, the possibility of coordination with HypF and the exploration of metals. Coordination of metals, HypF, spectrophotometry of ICP atoms, coordination of metals, and alignment of coordination metals. The results show that the metal is used to indicate that it is instigated to coordinate with each other.