分子認識能を持つDNAを利用した一塩基多型(SNPs)の簡便検出法の開発

本研究では、three-way junction構造を含むDNAと胆汁酸類の一種であるコール酸が結合すること、three-way junctionの分岐点上の一塩基が別の塩基に置き換えられるとその親和性が減少・消失することを利用して、新しいSNPs検出法の開発を行ってきた。昨年度まではBIAcoreを用いたSNPs検出法を構築してきたが、BIAcoreでは多サンプル同時測定が不可能であるという欠点があった。そこで最終年度では、本検出系をマイクロプレート上に展開し蛍光強度測定を行うことにより、多サンプル同時測定の系を確立することを目的とした。初めに、一本鎖でthree-way junction構造を形成するビオチン標識CH-16-40-18Gを、ストレプトアビジンでコーティングした96穴マイクロプレートに固定化した。これとオレゴングリーン標識されたコール酸とを反応させることによって、SNPsのタイピングが行えるか評価した。その結果、まず緩衝液中の塩濃度を増加させることにより蛍光強度が増加することを確認した。また、この条件を用いてHLA多型における一塩基変異検出を行った結果、パーフェクトマッチとミスマッチとの間に蛍光強度の差があることを確認した。さらに、実試料からのSNPs検出を想定し、二本鎖target DNAを熱変性しプローブDNAとthree-way junction構造を形成させて一塩基変異検出を試みたところ、同様にパーフェクトマッチとミスマッチとの蛍光強度の差を認めることができた。

本研究では、three-way junction構造を含むDNAと胆汁酸類の一種であるコール酸が結合すること、three-way junctionの分岐点上の一塩基が別の塩基に置き換えられるとその親和性が減少・消失することを利用して、新しいSNPs検出法の開発を行ってきた。昨年度まではBIAcoreを用いたSNPs検出法を構築してきたが、BIAcoreでは多サンプル同時測定が不可能であるという欠点があった。そこで最終年度では、本検出系をマイクロプレート上に展開し蛍光強度測定を行うことにより、多サンプル同時測定の系を確立することを目的とした。初めに、一本鎖でthree-way junction構造を形成するビオチン標識CH-16-40-18Gを、ストレプトアビジンでコーティングした96穴マイクロプレートに固定化した。これとオレゴングリーン標識されたコール酸とを反応させることによって、SNPsのタイピングが行えるか評価した。その結果、まず緩衝液中の塩濃度を増加させることにより蛍光強度が増加することを確認した。また、この条件を用いてHLA多型における一塩基変異検出を行った結果、パーフェクトマッチとミスマッチとの間に蛍光強度の差があることを確認した。さらに、実試料からのSNPs検出を想定し、二本鎖target DNAを熱変性しプローブDNAとthree-way junction構造を形成させて一塩基変異検出を試みたところ、同様にパーフェクトマッチとミスマッチとの蛍光強度の差を認めることができた。