Development of a novel gene modification system for obligate anaerobes and its application to environmental measures

本課題は、環境汚染物質であるテトラクロロエテン(PCE)を脱塩素化する偏性嫌気性細菌Desulfitobacterium hafniense Y51株を宿主として、難培養性偏性嫌気性細菌の機能未知タンパク質の機能解析や遺伝子発現を容易に行うことができる宿主ベクター系の開発を行うことを目的としている。本年度は、まず、内在性プラスミドを持つ脱塩素化細菌の探索を実施した。Y51株および菌株保存機関等から入手可能な脱塩素化細菌およびそれ以外の嫌気性細菌について、内在性プラスミドの有無を調べ、内在性プラスミドの取得を試みた。その結果、Y51株には内在性プラスミドは存在しなかった。その他の嫌気性細菌について文献検索し、Geobacter sulfurreducensで複製可能なプラスミドpCD354およびpBBR1、Lactobacillus helveticus由来プラスミドpLJ1、Desulfobacter hydrogenophilus由来の２種のプラスミド、Streptococcusと大腸菌のシャトルベクターpDL276、Lactococcus のシャトルベクターpTRKL2等が宿主ベクターの自己複製遺伝子領域に用いる候補として考えられた。内在性プラスミドが取得できなかった場合の計画通り、ベクターの構築を実施した。まず、形質転換体条件を検討するために、以下の２種類の相同組換えベクターを構築した。一つは、選択マーカーとしてKanR遺伝子を用い、選択マーカー遺伝子のプロモーターとしてY51株由来のpceA遺伝子のプロモーターを、相同組換え領域としてpceA遺伝子の上流および下流の各約800 bpをpHSG299に導入した。もう一つはpceA遺伝子の代わりにfdrA遺伝子のプロモーターおよびfrdA遺伝子の上流および下流の約800 bpをpHSG299に導入した。

本課題は、環境汚染物質であるテトラクロロエテン(PCE)を脱塩素化する偏性嫌気性細菌Desulfitobacterium hafniense Y51株を宿主として、難培養性偏性嫌気性細菌の機能未知タンパク質の機能解析や遺伝子発現を容易に行うことができる宿主ベクター系の開発を行うことを目的としている。本年度は、まず、内在性プラスミドを持つ脱塩素化細菌の探索を実施した。Y51株および菌株保存機関等から入手可能な脱塩素化細菌およびそれ以外の嫌気性細菌について、内在性プラスミドの有無を調べ、内在性プラスミドの取得を試みた。その結果、Y51株には内在性プラスミドは存在しなかった。その他の嫌気性細菌について文献検索し、Geobacter sulfurreducensで複製可能なプラスミドpCD354およびpBBR1、Lactobacillus helveticus由来プラスミドpLJ1、Desulfobacter hydrogenophilus由来の２種のプラスミド、Streptococcusと大腸菌のシャトルベクターpDL276、Lactococcus のシャトルベクターpTRKL2等が宿主ベクターの自己複製遺伝子領域に用いる候補として考えられた。内在性プラスミドが取得できなかった場合の計画通り、ベクターの構築を実施した。まず、形質転換体条件を検討するために、以下の２種類の相同組換えベクターを構築した。一つは、選択マーカーとしてKanR遺伝子を用い、選択マーカー遺伝子のプロモーターとしてY51株由来のpceA遺伝子のプロモーターを、相同組換え領域としてpceA遺伝子の上流および下流の各約800 bpをpHSG299に導入した。もう一つはpceA遺伝子の代わりにfdrA遺伝子のプロモーターおよびfrdA遺伝子の上流および下流の約800 bpをpHSG299に導入した。