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分子進化工学を用いた環境調和型水素生産システムの開発

利用分子进化工程开发环保制氢系统

基本信息

批准号：
09780502
负责人：
矢野和義
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、大腸菌内で水素生産に関与するタンパク質の役割を決定し、さらに分子進化工学を駆使することによってこれらを改変・進化させて、環境に負荷を与えない効率的な水素生産プロセスを構築することを目的としている。ヒドロゲナーゼ活性の調節遺伝子であるhypFの下流領域には4つのopen reading frame(ORF1-4)が存在する。その中のORF1は、DNA結合性タンパク質でヒドロゲナーゼ系タンパク質の一つであるFhlAと極めて相同性が高い。そこで今年度はこのFhlAの機能を解析することにした。ORF1遺伝子を高発現用ベクターpGEMに連結し、これを用いて大腸菌BL21を形質転換することによって、大腸菌によるORF1の高発現系を構築した。形質転換体にIPTGを添加することによってグルタチオン-S-トランスフェラーゼ-ORF1融合タンパク質の発現を誘導した。培養後の菌を超音波破砕し、破砕液をグルタチオン固定化カラムにとおした。カラムに結合した融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによって、ORF1をワンステップで精製した。また、ORF1と相互作用すると予想されるヒドロゲナーゼ系DNA断片をPCRによって増幅し、グルタチオンカラムに結合させた融合タンパク質と相互作用させた。しかし、タンパク質への非特異的吸着以外は観察されなかった。さらに、大腸菌ゲノムを制限酵素によって断片化したものを同様に融合タンパク質と相互作用させ、溶出、PCRによる増幅、のサイクルを繰り返した。現在第3世代まで得られたが、まだ特異的吸着量の増加は観測されていない。

This study is aimed at determining the relationship between water production in E. coli and molecular evolutionary engineering, and improving the efficiency of water production in E. coli. 4 open reading frames (ORFs 1-4) exist in the downstream domain of hypF. ORF1 in the Chinese language has a high similarity with FhlA and FhlA in the DNA binding property of the Tainpak substance. This year's FhlA function analysis ORF1 gene expression system was constructed using pGEM as a link and E. coli BL21 as a morphological marker. IPTG was added to the plasmid to induce the development of the ORF1 fusion protein. After culture, the bacteria were broken by ultrasonic wave, and the solution was immobilized. The combination of the two elements is very important to the success of the project. The interaction between ORF1 and DNA fragments is expected to increase in amplitude and fusion. A non-specific sorption of the substance is detected. In addition, E. coli must be controlled by enzyme, fragmentation, and fusion. Now the third generation has been found to have increased the specific adsorption amount.