骨誘導能をもつペプチドの新規開発とペプチド固定化ゲルの骨新生能の評価

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BMP-2の活性部位と推測されるアミノ酸配列を合成し、このBMP由来ペプチドの骨芽細胞誘導能とラット筋肉内異所性骨誘導能を評価した。BMP-2とTGF-β superfamilyのアミノ酸配列の相同性から、比較的保存されているアミノ酸配列68-87(NSVNS KIPKA CCVPT ELSAI)を選択して、化学的に合成した。BMP-2の刺激によって骨芽細胞様細胞に分化するマウス線維芽細胞株C3H10T1/2の培養上清にビオチン化ペプチドとFITC標識アビジン、あるいはCy5標識ペプチドを添加し、FITCあるいはCy5の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。ビオチン化、およびCy5標識BMP由来ペプチドを添加したC3H10T1/2の細胞表面特異的に蛍光が観察され、細胞膜表面受容体にBMP由来ペプチドが結合することが示された。BMP由来ペプチドを添加したC3H10T1/2の細胞溶解液を、抗リン酸化セリン抗体を用いてウエスタンブロット解析した。また、BMP由来ペプチドとレチノイン酸共存下でC3H10T1/2を3日間培養後、細胞溶解液のALP活性を測定した。BMP由来ペプチドを添加したC3H10Tl/2では、リン酸化SmadlとALP活性が増大した。次に、ラット(Wistar,6週齢,♂)の下腿部筋肉内にBMP由来ペプチドを結合したアルギン酸共有結合架橋ゲルを埋植した。4週間後に周辺組織とともに摘出し、HE染色、von Kossa染色等により石灰化の程度を評価した。また、石灰化部位の微小部X線回折を行った。BMP由来ペプチドを結合したアルギン酸共有結合架橋ゲルの埋植部位に、顕著な石灰化が認められ、石灰化部位周辺にオステオカルシン陽性の骨芽細胞様細胞が観察された。さらに、X線回折から石灰化物がヒドロキシアパタイトであることが確認された。