新規に樹立した耐性細胞からのマグネシウム輸送担体のクローニング

从新建立的耐药细胞中克隆镁转运蛋白

基本信息

批准号：
13877021
负责人：
松藤千弥
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

1.マグネシウム輸送タンパク質の候補遺伝子のスクリーニング:マウス尿細管由来MCT細胞から樹立したマグネシウム耐性株と対照野生株細胞それぞれから、poly(A)+RNAを抽出した。これらよりcDNAを合成し、サプレッション・サブトラクション・ハイブリダイゼーション法によりMg耐性細胞に特異的に発現している遺伝子をスクリーニングした。さらにNorthern blottingによる発現増強の確認と塩基配列解析を実施し、遺伝子発現・タンパク質データベースを参考にして14個の候補遺伝子を選択した。このうち4個は機能不明の遺伝子であった。残り10個が既知遺伝子で、そのうち1遺伝子が膜タンパク質であるCRR-9(Cisplatin-resistance related gene-9)であった。これらと平行してDNAマイクロアレイ(Affymetryx製GeneChip, Murine U74A Genome Array A)を用いて両細胞株の包括的な発現比較を実施した。その結果に基づきMg耐性細胞に特異的に発現が増加している約100種の遺伝子を選出し、現在これらの機能・発現について検討している。2.マグネシウム輸送蛋白質の同定:発現解析の結果最も候補遺伝子の可能性が高いと考えられたCRR-9のcDNAを、CMVプロモーターを有する動物細胞一過性発現ベクターに組み込み、リポフェクチン法を用いて野生体MCT細胞に遺伝子導入した。しかし、マグネシウム耐性の明らかな増大は認められず、感受性色素を用いた排出活性測定法でもマグネシウム輸送活性の促進は認められなかった。したがって、CRR-9の発現増強は細胞内マグネシウム濃度の上昇によるもの、またはマグネシウム耐性を与える変異の結果である可能性が考えられた。

1。筛查镁转运蛋白的候选基因：从耐镁和对照的野生线细胞中提取poly（a）+ RNA，这些细胞是从小鼠小管衍生的MCT细胞中建立的。通过这些cDNA合成这些cDNA，并通过抑制，减法和杂交筛选在MG耐药细胞中特异性表达的基因。此外，通过Northern印迹证实了表达增强，并进行了核苷酸序列分析，并使用基因表达和蛋白质数据库选择了14个候选基因。其中四个是功能未知的基因。其余10个是已知的基因，其中之一是膜蛋白CRR-9（抗铂与抗性相关的基因-9）。与这些同行，使用DNA微阵列（Genechip，由AffyMetryx制造的Murine U74A基因组阵列A）进行了两种细胞系的全面表达比较。根据结果，已经选择了大约100个具有MG耐药细胞特异性表达的基因，目前正在研究这些功能和表达。 2。鉴定镁转运蛋白：CRR-9的cDNA被认为是最有可能的候选基因，被掺入携带CMV启动子的动物细胞的瞬态表达载体中，然后使用脂纤维蛋白法转染到野生MCT细胞中。但是，未观察到镁耐药性的明显增加，即使在使用敏感染料的外排活性测定中，也没有观察到镁转运活性。因此，据认为，CRR-9的表达增强可能是由于细胞内镁浓度增加或突变赋予镁耐药性的结果。