水チャネル(アクアポリン2)過剰発現ラットの作製によるSIADHの病態解析

我々は本研究においてバゾプレシン不適合分泌症候群(SIADH)のモデル動物の確立及び腎性尿崩症の遺伝子治療の開発を目的として、アクアポリン2(AQP2)過剰発現トランスジェニックラットの作製を計画した。そこでまず、AQP2及びバゾプレシンV2受容体(V2R)の遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製し、動物個体に投与して体内で発現させることを試みた。ラットの腎髄質よりRNAを抽出し、RT-PCRでAQP2およびV2Rの全長cDNAを得た。これを、TA cloningで増幅し、autosequencerで塩基配列を確認した後、発現ベクターであるpcDNAに組み込んだ。この段階で目的とする蛋白が発現されるかをReticulocyte Lysate systemを用いたin vitro translationで確認した。次いで、実際に個体で発現させるべく、このDNAをラット及びマウスの大腿四頭筋に注射した。注射は週に1回、計5回行った。最終注射の2週間後に動物より筋組織を採取した。現在、筋組織でのV2R及びAQP2のmRNAと蛋白の発現をWestern blotting及びNorthern blottingにて検討を行っている。また筋で蛋白が発現すればそれに対する抗体が産生される可能性があるので、血清を採取しAQP2及びV2Rに対する抗体の出現を観察中である。次の段階としては、このDNAを腎動脈より、あるいは尿路から逆行性に投与して腎での発現を試みる予定である。腎での発現が認められれば、生体内でのAQP2及びV2Rの機能の再現が可能と考えられ、SIADHモデルとしての使用、あるいは腎性尿崩症の遺伝子治療への応用が期待される。

我々は本研究においてバゾプレシン不適合分泌症候群(SIADH)のモデル動物の確立及び腎性尿崩症の遺伝子治療の開発を目的として、アクアポリン2(AQP2)過剰発現トランスジェニックラットの作製を計画した。そこでまず、AQP2及びバゾプレシンV2受容体(V2R)の遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製し、動物個体に投与して体内で発現させることを試みた。ラットの腎髄質よりRNAを抽出し、RT-PCRでAQP2およびV2Rの全長cDNAを得た。これを、TA cloningで増幅し、autosequencerで塩基配列を確認した後、発現ベクターであるpcDNAに組み込んだ。この段階で目的とする蛋白が発現されるかをReticulocyte Lysate systemを用いたin vitro translationで確認した。次いで、実際に個体で発現させるべく、このDNAをラット及びマウスの大腿四頭筋に注射した。注射は週に1回、計5回行った。最終注射の2週間後に動物より筋組織を採取した。現在、筋組織でのV2R及びAQP2のmRNAと蛋白の発現をWestern blotting及びNorthern blottingにて検討を行っている。また筋で蛋白が発現すればそれに対する抗体が産生される可能性があるので、血清を採取しAQP2及びV2Rに対する抗体の出現を観察中である。次の段階としては、このDNAを腎動脈より、あるいは尿路から逆行性に投与して腎での発現を試みる予定である。腎での発現が認められれば、生体内でのAQP2及びV2Rの機能の再現が可能と考えられ、SIADHモデルとしての使用、あるいは腎性尿崩症の遺伝子治療への応用が期待される。