遺伝子導入法を用いたヒト破骨細胞の形態・機能解析法の確立

基因转移法建立人破骨细胞形态和功能分析方法

• 批准号: 13877306
• 负责人: 後藤 哲哉
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyushu Dental College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877306/
• 关键词: HL-60; 遺伝子導入; electroporation; 破骨細胞; actin; pEGF; in vitro; 機能解析

本研究においてはまず、in vitroで確実にヒト破骨細胞を形成させる方法の確立を行った。破骨細胞の前駆細胞としてはヒト単球のcell lineであるHL-60を用いた。HL-60をRPMI1640培養液に、活性型ビタミンD_3、M-CSF、RANKLを加えさらに20%のFCSを加えて2週間培養して酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色を行った。その結果、5種類のロットのFCSのうち2種類のもので多核の破骨細胞が形成された。HL-60細胞は培養7日目で融合を始め、多核化し、培養10日目ころからTRAP陽性細胞が認められた。以後、破骨細胞の形成にはこの系を用いることとした。遺伝子導入はまず、Clontech社のactin融合pEGFPベクターを用いた。HL-60細胞への遺伝子導入にはelectroporation法を用いた。種々の細胞濃度および電圧で遺伝子導入を行い、もっとも効率の良かった条件で以後のelectroporationを行った。Actin融合pEGFベクターを導入したHL-60細胞はG418添加の培養液によりクローニングを行った。こうしてできたActin融合pEGFベクター導入HL-60細胞を用い上記の破骨細胞分化条件で培養を行った。その結果、Actin融合pEGFベクター導入HL-60細胞でもTRAP陽性の破骨細胞の形成が認められた。次年度は、このActin融合pEGFベクター導入破骨細胞を用いて破骨細胞の機能解析を行う予定である。

This study aims to establish a method for the formation of osteoclasts in vitro. HL-60 is used in osteoclast precursor cells. HL-60, RPMI1640 medium, active type D_3, M-CSF, RANKL, 20% FCS, 2 weeks culture, tartaric acid resistant acid, TRAP staining. As a result, 5 kinds of FCS were formed and 2 kinds of multinucleated osteoclasts were formed. HL-60 cells were cultured for 7 days before fusion and multinucleation. TRAP positive cells were cultured for 10 days before fusion. After that, osteoclast formation is the first step in the process of osteoclast formation. Gene introduction, Clontech's actin fusion pEGFP HL-60 cells were successfully transfected with DNA by electroporation. The cell concentration of the seed is too high for the introduction of the seed, and the conditions for the introduction of the seed are too high. Actin fusion pEGF was introduced into HL-60 cells and G418 was added to the culture medium. Introduction of pEGF fusion into HL-60 cells using the above-mentioned osteoclast differentiation conditions Actin fusion pEGF was introduced into HL-60 cells and the formation of TRAP-positive osteoclasts was recognized. The next year, Actin fusion pEGF was introduced into osteoclasts and the function of osteoclasts was analyzed.