遺伝子導入法を用いたヒト破骨細胞の形態・機能解析法の確立

本研究においてはまず、in vitroで確実にヒト破骨細胞を形成させる方法の確立を行った。破骨細胞の前駆細胞としてはヒト単球のcell lineであるHL-60を用いた。HL-60をRPMI1640培養液に、活性型ビタミンD_3、M-CSF、RANKLを加えさらに20%のFCSを加えて2週間培養して酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色を行った。その結果、5種類のロットのFCSのうち2種類のもので多核の破骨細胞が形成された。HL-60細胞は培養7日目で融合を始め、多核化し、培養10日目ころからTRAP陽性細胞が認められた。以後、破骨細胞の形成にはこの系を用いることとした。遺伝子導入はまず、Clontech社のactin融合pEGFPベクターを用いた。HL-60細胞への遺伝子導入にはelectroporation法を用いた。種々の細胞濃度および電圧で遺伝子導入を行い、もっとも効率の良かった条件で以後のelectroporationを行った。Actin融合pEGFベクターを導入したHL-60細胞はG418添加の培養液によりクローニングを行った。こうしてできたActin融合pEGFベクター導入HL-60細胞を用い上記の破骨細胞分化条件で培養を行った。その結果、Actin融合pEGFベクター導入HL-60細胞でもTRAP陽性の破骨細胞の形成が認められた。次年度は、このActin融合pEGFベクター導入破骨細胞を用いて破骨細胞の機能解析を行う予定である。

本研究においてはまず、in vitroで確実にヒト破骨細胞を形成させる方法の確立を行った。破骨細胞の前駆細胞としてはヒト単球のcell lineであるHL-60を用いた。HL-60をRPMI1640培養液に、活性型ビタミンD_3、M-CSF、RANKLを加えさらに20%のFCSを加えて2週間培養して酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色を行った。その結果、5種類のロットのFCSのうち2種類のもので多核の破骨細胞が形成された。HL-60細胞は培養7日目で融合を始め、多核化し、培養10日目ころからTRAP陽性細胞が認められた。以後、破骨細胞の形成にはこの系を用いることとした。遺伝子導入はまず、Clontech社のactin融合pEGFPベクターを用いた。HL-60細胞への遺伝子導入にはelectroporation法を用いた。種々の細胞濃度および電圧で遺伝子導入を行い、もっとも効率の良かった条件で以後のelectroporationを行った。Actin融合pEGFベクターを導入したHL-60細胞はG418添加の培養液によりクローニングを行った。こうしてできたActin融合pEGFベクター導入HL-60細胞を用い上記の破骨細胞分化条件で培養を行った。その結果、Actin融合pEGFベクター導入HL-60細胞でもTRAP陽性の破骨細胞の形成が認められた。次年度は、このActin融合pEGFベクター導入破骨細胞を用いて破骨細胞の機能解析を行う予定である。