単一神経細胞内遺伝子発現の新たな解析方法の開発

开发分析单个神经元基因表达的新方法

• 批准号: 13878169
• 负责人: 福田 淳
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13878169/
• 关键词: 網膜神経節細胞; mRNA; 細胞内注入; biotin; avidin; rat; 紫外線照射; 蛍光顕微鏡

本研究の目的は、組織内の単一ニューロンで発現しているmRNAを解析する方法として、核酸標識物の細胞内注入を利用した新しい単一ニューロン内遺伝子発現の解析法方法を確立することにある。考案した新しい方法は次の3つのステップからなる。(1)ガラス微小管に封入したビオチン化標識物質を顕微鏡下で目的の細胞内に注入した後、その細胞に可視光を照射して細胞内のmRNAと標識物質を結合させる。(2)注入細胞を含む組織からmRNAを抽出したのち、注入細胞由来のビオチン標識mRNAをアビジンを用いて分離精製する。(3)分離した標識mRNAに対するcDNAを逆転写反応により合成し、これをテンプレートとしてPCR法によって増幅する。そこで、摘出したラット網膜を蛍光顕微鏡(オリンパスAX70)下で維持しながら、ビオチン化標識物質(PhotoprobeBiotinTM, Vector社、以下PPB)を圧注入装置を用いて網膜神経節細胞に細胞内注入した。PPBはin vitroで紫外光照射または加熱により核酸に結合する性質を持つので、蛍光顕微鏡の対物レンズを通じて注入細胞の細胞体に紫外光を5分、10分、15分、20分、または30分間照射した。注入細胞を含む網膜組織片からRNA精製キット(QuickPrep Micro mRNA Purification Kit, Amersham)を用いてmRNAを精製したが、ビオチン標識されたmRNAを検出することが出来なかった。本法で単一ニューロンで発現しているmRNAを無傷で抽出・精製するためには、細胞内注入時に細胞を機械的に損傷する点と短時間で細胞内でPPBとmRNAを結合させるための更なる技術開発が必要である。

は の purpose, this study organization の 単 a ニ ュ ー ロ ン で 発 now し て い る mRNA を parsing す る method と し て, nucleic acid marker の intracellular injection を using し た new し い 単 a ニ ュ ー ロ ン heritage within 伝 son 発 analytical method is の way を establish す る こ と に あ る. Case study: た New た method た subdivision た 3 ステップ ステップ ステップ らなる らなる. Tiny tube (1) ガ ラ ス に し sealed た ビ オ チ ン change logo material を 顕 micro microscopically で purpose に の cell injection し た, そ に の cells visible light を irradiation し て in cells の mRNA と logo material を さ せ る. (2) the injected cells を む tissue か ら mRNA を spare し た の ち, injection cell origin の ビ オ チ ン logo mRNA を ア ビ ジ ン を with い て separation of refined す る. (3) separation し た logo mRNA に す seaborne る cDNA を inverse planning to write the 応 に よ り synthetic し, こ れ を テ ン プ レ ー ト と し て PCR method に よ っ て rights of す る. そ こ で, pick the し た ラ ッ ト retinal を 蛍 light 顕 micro mirror (オ リ ン パ ス AX70) under で maintain し な が ら, ビ オ チ ン change logo material (below PhotoprobeBiotinTM, Vector club, PPB) を 圧 injection device を with い て god 経 retinal ganglion cells に intracellular injection し た. PPB は in vitro で uv-irradiation ま た は heating に よ り nucleic acid に combining す る nature を hold つ の で 蛍 light 顕 micromirror の content レ seaborne ン ズ を tong じ て injected cells の cell body に ultraviolet を 5, 10, 15, 20 points, ま た は 30 points between irradiation し た. Injected cells を む retinal tissue slice か ら RNA refined キ ッ ト (QuickPrep Micro mRNA Purification Kit, Amersham) を with い て mRNA を refined し た が, ビ オ チ ン logo さ れ た mRNA を 検 out す る こ と が out な か っ た. This law で 単 a ニ ュ ー ロ ン で 発 now し て い る mRNA を without injury で drew, refined す る た め に は, intracellular injection を mechanical に に cell damage when す る point と で cells within short time で PPB と mRNA を combining さ せ る た め の more な る technology open 発 が necessary で あ る.

项目成果

Sauve, Y. et al.: "Topographic specificity in reinnervation of the superior colliculus by regenerated retinal ganglion cell axons in adult hamsters"J.Neurosci.. 21. 951-960 (2002)

Sauve, Y. 等人：“成年仓鼠再生视网膜神经节细胞轴突对上丘神经支配的地形特异性”J. Neurosci.. 21. 951-960 (2002)

矢倉 徹 他: "哺乳類の視交叉 同側性視神経投射形成のメカニズムを中心に"脳21. 5(1). 14-18 (2002)

Toru Yagura 等：“哺乳动物视交叉：关注同侧视神经投射形成的机制”Brain 21. 5(1) (2002)。

Watanabe, M. et al.: "survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats : quantitative study within two weeks"Visual Neurosci. 18. 137-145 (2001)

Watanabe, M. 等人：“成年猫视神经横断后视网膜神经节细胞的存活：两周内的定量研究”Visual Neurosci。

澤井 元: "軸索切断による逆行性変性過程にグルタミン酸毒性は関与しているか"Molecular Medicine. 39. 80-86 (2002)

Hajime Sawai：“谷氨酸毒性是否参与轴索切除术引起的逆行变性过程？” 39. 80-86 (2002)。

矢倉 徹 他: "生後発生過程における同側性網膜-上丘投射のrefinementのメカニズム"Molecular Medicine. 39. 175-184 (2002)

Toru Yagura 等人：“产后发育过程中同侧视网膜上丘投影的细化机制”《分子医学》39. 175-184 (2002)。