活性酸素種発生を指標としたストレスシグナルの解析

使用活性氧生成作为指标来分析压力信号

• 批准号: 15657042
• 负责人: 久下 周佐
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15657042/
• 关键词: 活性酸素種; Yap1; FRET; 蛍光エネルギー移動法; GFP; シグナルの可視化; 活性酸素シグナル; レドックスシグナル

我々は、出芽酵母の酸化ストレス感知蛋白質であるYap1転写因子が、酸化ストレス(活性酸素種)を受け取ってジスルフェド結合を起こすことを示してきた。本研究では、Yap1の制御ドメインを用いて活性酸素種の発生・消失を生細胞内でリアルタイムに可視化することを目的としてしいる。Yap1のN末端およびC末端に緑色蛍光蛋白質のCFPおよびYFPを融合しYap1-FRETを構築した。この場合、420nmでYap1-FRETのCFPを励起させた時に、CFPをYFPが構造上近い位置に存在した場合は蛍光エネルギー移動(FRET)によりYFPが励起され535nmの蛍光強度(FRET強度)が増強されるが、離れている場合はCFPの480nmの蛍光強度が高くなると考えられる。Yap1-FRETを、細胞質が酸化的に傾いている変異細胞(チオレドキシン欠損株)内発現された場合にのみFRET強度が上昇すること、このFRET強度は還元剤の培地中への添加により数十秒以内に減少することが判明した。そこで、野生株の細胞質で(より還元状態で)活性酸素種を感知するYap1-FRETを得る目的で、Yap1制御ドメインにランダムに変異を付加した後に、Yap1の転写能(酵母の酸化ストレス感受性)を指標とした酵母遺伝学的スクリーニングを行った。その結果、取得した変異型Yap1-FRETを発現させた生細胞内で、ミトコンドリアから発生したと考えられる活性酸素を定量的・空間的に可視化することに成功した。現在、ヒト培養細胞内でのYap1-FRETの発現にも成功しており、解析が進んでいる。本研究成果は、増殖シグナルや細胞の生死の方向性を決定するシグナルとしての活性酸素種(レドックスシグナル)の時空的シグナルの可視化につながり関連分野に与える影響は大きい。

I 々 は, budding yeast の acidification ス ト レ ス perception protein で あ る Yap1 planning write factor が, acidification ス ト レ ス element (active acid) を by け take っ て ジ ス ル フ ェ ド combining を up こ す こ と を shown し て き た. This study で は, Yap1 の suppression ド メ イ ン を with い て acid active element of の 発 raw, disappear を raw intracellular で リ ア ル タ イ ム に visualization す る こ と を purpose と し て し い る. Yap1 <s:1> n-terminal および c-terminal に green 蛍 photoprotein <s:1> CFPおよびYFPを fuses with <s:1> yap1-fret を to construct た た. こ の occasions, 420 nm で Yap1 - FRET の CFP を wound up さ せ た に, CFP を YFP が tectonic position nearly い に exist on し た occasions は 蛍 light エ ネ ル ギ ー mobile (FRET) に よ り YFP が wound up さ れ 535 nm の 蛍 light intensity (FRET) intensity が raised strong さ れ る が from れ て い る occasions は CFP の The 480nm 蛍 has a high light intensity が and くなると tests えられる. Yap1 - FRET を and tilt cytoplasm が acidification に い て い る - different cells (チ オ レ ド キ シ ン owe damage strain) in 発 now さ れ た occasions に の み FRET strength rising が す る こ と, こ の は yuan tonic の also FRET strength in petty へ の add に よ り tens of seconds に reduce す る こ と が.at し た. そ こ で, wild strains の cytoplasm で (よ り yuan state で) also active acid element of を perception す る Yap1 - FRET を で る purpose, Yap1 suppression ド メ イ ン に ラ ン ダ ム に - different を plus し た に, Yap1 の planning can write (yeast の acidification ス ト レ ス susceptibility) を index と し た yeast but 伝 learn ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. そ の results, get し た - alien Yap1 - FRET を 発 now さ せ た で within living cells, ミ ト コ ン ド リ ア か ら 発 raw し た と exam え ら れ る を quantitative, active acid element space に visualization す る こ と に successful し た. Now, in the ヒト cultured cells, で <s:1> Yap1-FRET <s:1> occurs に ヒト successfully てお てお and が are analyzed into んで んで る る. This study results は, raised colonization シ グ ナ ル や cell の の directional を life and death decision す る シ グ ナ ル と し て の element of active acid (レ ド ッ ク ス シ グ ナ ル) の spatio-temporal シ グ ナ ル の visualization に つ な が り masato even eset に with え る は affected き い.