酵母を利用したIRES依存的翻訳開始因子のクローニング

使用酵母克隆 IRES 依赖性翻译起始因子

• 批准号: 07780595
• 负责人: 久下 周佐
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780595/
• 关键词: PTB; binding prptein; Two-hybrid system; IRES; 蛋白合成開始; ピコルナウイルス; C型肝炎ウイルス; 酵母

ポリオウイルス、リノウイルスなどのピコルナウイルスそしてC型肝炎ウイルスなどの一本鎖RNAウイルスはIRES (internal ribosome entry site)をmRNAの翻訳領域の5'側に持ち、その蛋白合成はCAP構造に依存せず開始される。この場合まず何らかの因子がIRESを認識し、さらに蛋白合成開始因子そしてリボゾームが導入されることが考えられている。IRESを認識する因子の一つとしてPTB (polypyrimidine tract binding protein)が報告されており、さらにPTBを含む複数の蛋白がIRESによる蛋白合成を誘導することが試験管内の実験から示されている。従ってPTBに結合する蛋白の明らかにすることはこの特殊な蛋白合成系を理解するために必須である。本研究ではPTB結合蛋白のcDNAをクローニングする目的でTwo-hybrid systemを導入し、HeLa細胞由来のcDNAライブラリー(Two-hybrid systemスクリーニング用、GAL4転写活性化領域のタグを持つ)をスクリーニングした。PTB蛋白-SRF(Serum response factor) DNA結合ドメインの融合蛋白を発現させた指示酵母(HIS/L1)を用いて200万クローン相当をスクリーニングし、レポーター遺伝子であるHIS3及びlacZ両遺伝子を活性化することができる15クローンを回収した。これらの構造を解析した結果、内13クローンは同一のcDNAに由来しており、HeLa細胞内で約3.5K塩基長のmRNAとして発現されていることが判明した。また塩基配列解析の結果からこのcDNAは米国ゲノムプロジェクトで解析されているcDNAの一つと同一であることが明らかとなったが、その機能は不明であり、現在このcDNAにコードされる蛋白がPTB蛋白とどのような条件で結合するかまたIRES構造-PTB複合体とどの様に関わるの解析を行っている。

The 5'side of the mRNA translation domain is maintained at the 5' side of the IRES (internal ribosome entry site), and protein synthesis begins at the CAP structure dependent region. In this case, the factor of protein synthesis initiation is recognized as IRES, and the factor of protein synthesis initiation is introduced as IRES. IRES is recognized as a factor in PTB (polypeptide tract binding protein), and PTB is reported as a protein containing multiple IRES proteins, and protein synthesis is induced by IRES. The expression of PTB is essential for understanding the specific protein synthesis system. In this study, the cDNA for PTB-binding protein was introduced into HeLa cells for the purpose of identifying the cDNA for PTB-binding protein. PTB protein-SRF (Serum Response Factor) DNA binding protein fusion protein was developed and the indicator yeast (HIS/L1) was used for the activation of HIS3 and lacZ gene fusion proteins in 2 million samples. As a result of structural analysis, it was found that the mRNA of HeLa cells with a base length of about 3.5 K was generated from the same cDNA. As a result of gene alignment analysis, the cDNA was analyzed for the same cDNA sequence as the PTB protein sequence. The cDNA sequence was analyzed for the same cDNA sequence as the PTB protein sequence.