酵母を利用したIRES依存的翻訳開始因子のクローニング

ポリオウイルス、リノウイルスなどのピコルナウイルスそしてC型肝炎ウイルスなどの一本鎖RNAウイルスはIRES (internal ribosome entry site)をmRNAの翻訳領域の5'側に持ち、その蛋白合成はCAP構造に依存せず開始される。この場合まず何らかの因子がIRESを認識し、さらに蛋白合成開始因子そしてリボゾームが導入されることが考えられている。IRESを認識する因子の一つとしてPTB (polypyrimidine tract binding protein)が報告されており、さらにPTBを含む複数の蛋白がIRESによる蛋白合成を誘導することが試験管内の実験から示されている。従ってPTBに結合する蛋白の明らかにすることはこの特殊な蛋白合成系を理解するために必須である。本研究ではPTB結合蛋白のcDNAをクローニングする目的でTwo-hybrid systemを導入し、HeLa細胞由来のcDNAライブラリー(Two-hybrid systemスクリーニング用、GAL4転写活性化領域のタグを持つ)をスクリーニングした。PTB蛋白-SRF(Serum response factor) DNA結合ドメインの融合蛋白を発現させた指示酵母(HIS/L1)を用いて200万クローン相当をスクリーニングし、レポーター遺伝子であるHIS3及びlacZ両遺伝子を活性化することができる15クローンを回収した。これらの構造を解析した結果、内13クローンは同一のcDNAに由来しており、HeLa細胞内で約3.5K塩基長のmRNAとして発現されていることが判明した。また塩基配列解析の結果からこのcDNAは米国ゲノムプロジェクトで解析されているcDNAの一つと同一であることが明らかとなったが、その機能は不明であり、現在このcDNAにコードされる蛋白がPTB蛋白とどのような条件で結合するかまたIRES構造-PTB複合体とどの様に関わるの解析を行っている。

ポリオウイルス、リノウイルスなどのピコルナウイルスそしてC型肝炎ウイルスなどの一本鎖RNAウイルスはIRES (internal ribosome entry site)をmRNAの翻訳領域の5'側に持ち、その蛋白合成はCAP構造に依存せず開始される。この場合まず何らかの因子がIRESを認識し、さらに蛋白合成開始因子そしてリボゾームが導入されることが考えられている。IRESを認識する因子の一つとしてPTB (polypyrimidine tract binding protein)が報告されており、さらにPTBを含む複数の蛋白がIRESによる蛋白合成を誘導することが試験管内の実験から示されている。従ってPTBに結合する蛋白の明らかにすることはこの特殊な蛋白合成系を理解するために必須である。本研究ではPTB結合蛋白のcDNAをクローニングする目的でTwo-hybrid systemを導入し、HeLa細胞由来のcDNAライブラリー(Two-hybrid systemスクリーニング用、GAL4転写活性化領域のタグを持つ)をスクリーニングした。PTB蛋白-SRF(Serum response factor) DNA結合ドメインの融合蛋白を発現させた指示酵母(HIS/L1)を用いて200万クローン相当をスクリーニングし、レポーター遺伝子であるHIS3及びlacZ両遺伝子を活性化することができる15クローンを回収した。これらの構造を解析した結果、内13クローンは同一のcDNAに由来しており、HeLa細胞内で約3.5K塩基長のmRNAとして発現されていることが判明した。また塩基配列解析の結果からこのcDNAは米国ゲノムプロジェクトで解析されているcDNAの一つと同一であることが明らかとなったが、その機能は不明であり、現在このcDNAにコードされる蛋白がPTB蛋白とどのような条件で結合するかまたIRES構造-PTB複合体とどの様に関わるの解析を行っている。