FRETを用いた生細胞内でのフリーラジカル可視化システムの構築

使用 FRET 构建活细胞自由基可视化系统

• 批准号: 14658199
• 负责人: 久下 周佐
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658199/
• 关键词: FRET; GFP; Yapl; 酸化ストレス; レドックスシグナル; 感知; 分子生物学; 可視化

生細胞内で活性酸素種を検知するために、出芽酵母の酸化ストレスセンサー蛋白質Yap1の構造変化を可視化するシステムを構築した。具体的には、Yap1に2種類の緑色蛍光蛋白質(GFP)の誘導体蛋白質を融合して蛍光エネルギー転移(FRET)の強度変化を観察することにより検出する。1)Yaplの制御ドメインのN末端側、C末端側にCFPおよびYFPを融合させ発現させた(Yap1融合蛋白質)。その結果、酸化的な酵母変異株内でFRETをおこし還元剤で処理するとFRETが減少し、Yap1の構造変化がこのシステムで可視化できることを示唆した。2)FRETの効率化:Yap1融合蛋白質が細胞質の還元状態で酸化ストレスによりFRETが起こるようにランダムな変異を導入することにより改変した。その結果、Yap1融合蛋白質の感度が上昇した。3)Yap1融合蛋白質をHEK293細胞に導入した。ER内に局在化させるシグナルを付加して観察した結果、Yap1融合蛋白質の蛍光が観察された。本研究により、このYap1検知システムが細胞内の活性酸素種の発生、または外部からの浸入を時間的、空間的に可視化する強力なツールになり得ることが強く示唆された。今後、動物細胞における活性酸素シグナルの検出系として、このYap1融合蛋白質を培養細胞に導入して、酸化ストレス、サイトカイン刺激による活性酸素発生をFRETとシグナルとして検出、時間的変化を検出する予定である。細胞内における活性酸素種などのフリーラジカルの検出は蛍光物質を用いて行われるが、汎用される試薬はフリーラジカルとの反応生成物を検出するため反応が不可逆的である。また、蛍光物質では細胞内の発生場所などを特定できないが、本研究で開発された方法はこの点も解決するものと期待される。

The structure of protein Yap1 was visualized by enzyme digestion and enzyme digestion. Specifically, Yap1 and 2 types of green fluorescent protein (GFP) and inducer proteins were fused and intensity changes of fluorescent protein shift (FRET) were observed. 1) Yap1 fusion protein was developed on the N-terminal and C-terminal sides of the Yap1 gene. The result of acidification is that FRET is reduced and Yap1 is transformed into FRET. 2)FRET efficiency: Yap1 fusion protein is transformed from cytosol to cytosol. As a result, the sensitivity of Yap1 fusion protein increased. 3)Yap1 fusion protein was introduced into HEK293 cells. The results of this study were as follows: Yap1 fusion protein was detected in E. In this study, we found that the production of active acid species in cells, the external penetration, the temporal and spatial visualization, and the strong expression of active acid species in cells were detected. In the future, animal cells in the active acid production system, such as Yap1 fusion protein introduced into cultured cells, acidification, cell stimulation, active acid production, FRET, detection, time change, the predetermined time. In the cell, the active acid species are produced in a way that is irreversible in the presence of photoactive substances. This study aims to develop a new method for solving the problem of intracellular growth of fluorescent substances.

项目成果

Isoyama, T., K.Kuge, S.Nomto, A.: "The core protein of hepatitis C virus is imported into the nucleus by transport receptor Kap123p but inhibits Kap 121p-dependent nuclear import of yeast AP1-like transcription factor in yeast cells"The Journal of Biologi

Isoyama, T.、K.Kuge、S.Nomto, A.：“丙型肝炎病毒的核心蛋白通过转运受体 Kap123p 输入细胞核，但会抑制酵母中依赖 Kap 121p 的酵母 AP1 样转录因子的核输入