新規メカニズムによるイオンチャネル作用薬の効率的探索法の開発

利用新颖机制开发离子通道激动剂的有效搜索方法

• 批准号: 15659040
• 负责人: 今泉 祐治
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659040/
• 关键词: 電位感受性色素; オキソノール化合物; イオンチャネル; イオンチャネル作用薬; 膜電位感受性色素; カリウムチャネル; 高効率薬物候補検索; 創薬

現在、汎用されている代表的なオキソノール系蛍光色素としてDiBAC_4(n)やDisBAC_4(n)などが挙げられる。陰イオンであるDiBACは細胞膜を良く透過するため、細胞外液中に存在させると膜電位差が減少した時には細胞内へより多く分布し、不特定の細胞質蛋白と結合して、細胞内からの蛍光強度を増す。細胞外のfreeのDiBACは微弱な蛍光しか発しない。アーチファクトが生じやすい理由は、本来は極めて短い色素の蛍光寿命が、不特定の細胞質蛋白との結合により延長されて測定が可能となっているという根本的な測定原理に由来する。蛋白と色素の結合に影響を与える化合物は、イオンチャネルに作用しなくても蛍光強度を変化させるからである。上記の欠点を解消するため、次のような系を考案した。DiBAC系膜電位感受性蛍光色素に標識化学構造を化学合成により付加した。一方、その標識部位を特異的に認識する蛋白を遺伝子導入により細胞に高発現させることを試みた。付加的化学構造を持つ色素は特異的結合蛋白に優先的に結合するため、不特定の細胞内蛋白との結合は防がれ、かつより高効率の蛍光を発することが可能性となると考えた。構造が比較的単純な精巣型アンジオテンシン転換酵素タンパクの一部とその阻害薬カプトプリル類縁化合物の利用を検討した。特異的結合蛋白を低分子化することにより色素との結合・解離速度を上昇させることができると想定した。以上から、当方法によりアーチファクトの減少と反応速度の上昇が得られると推測し検討を加えたものの、現在のところ従来と比較して明らかな反応速度の変化は観察されていない。DiBACが既に細胞質のタンパクのうちでも比較的低分子なものに良く結合していた可能性、まだ低分子化が不足している可能性、細胞内では何らかの理由で結合能が低下しているなどの理由が考えられるのでさらに検討が必要である。

目前，代表性的基于氧醇的荧光染料为DIBAC_4（N）和DISBAC_4（N）。 DIBAC是一种阴离子，通过细胞膜很好地穿透，因此当它存在于细胞外液中时，当膜电位差减小时，它在细胞内分布更多，与未指定的细胞质蛋白结合，从而增加细胞内的荧光强度。细胞外的无二迪巴克仅发射轻度荧光。伪造容易发生的伪影的原因是从基本的测量原理中得出的，其中染料的荧光寿命最初是非常短的染料，是通过与未指定的细胞质蛋白结合而扩展的，从而使其有可能进行测量。这是因为影响蛋白质-DYE结合的化合物会改变荧光强度而不会影响离子通道。为了克服上述缺点，设计了以下系统：通过化学合成，将标记的化学结构添加到基于DIBAC的膜电位敏感荧光染料中。另一方面，我们试图高度表达一种蛋白质，该蛋白质通过基因转移专门识别细胞中的标记位点。由于具有其他化学结构的染料优先与特定的结合蛋白结合，因此我们认为可以防止与未指定的细胞内蛋白结合，并且可以发出更有效的荧光。我们研究了一些具有相对简单的结构及其抑制剂Captopril相关化合物的睾丸血管紧张素转化酶蛋白的使用。假定通过将特定的结合蛋白转化为小分子，可以增加与染料的结合和解离速率。从以上，我们推测该方法将降低伪影并提高反应速率，尽管我们现在已经对其进行了研究，但与常规方法相比，反应率没有明显变化。需要进一步研究，因为有可能的原因，例如DIBAC已经与相对较小的分子绑定在一起，其可能仍然缺乏小分子的可能性，并且由于某种原因，细胞内的结合能力也会降解。

项目成果

Hatano N. et al.: "Two arginines in C-terminus domain are essential for the voltage-dependent regulation of A-type K^+ current in the Kv4 channel subfamily"Journal of Biological Chemistry. 279(7). 5450-5459 (2004)

Hatano N.等人：“C末端结构域中的两个精氨酸对于Kv4通道亚家族中A型K+电流的电压依赖性调节至关重要”生物化学杂志。

Ohwada T. et al.: "Dehydroabietic acid derivatives as a novel scaffold for large-conductance calcium-activated K^+ channel openers"Bioorg.Med.Chem.Lett.. 13(22). 3971-3974 (2003)

Ohwada T.等人：“脱氢松香酸衍生物作为大电导钙激活K + 通道开放剂的新型支架”Bioorg.Med.Chem.Lett.. 13(22)。

KB-R7943 reveals possible involvement of Na^+-Ca^<2+> exchanger in elevation of intracellular Ca^<2+> in rat carotide arterial myocytes

KB-R7943揭示Na^-Ca^2交换器可能参与大鼠颈动脉肌细胞细胞内Ca^2升高

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Smooth Muscle Research 40
• 作者: Liu H.-N.et al.;Liu H.-N.et al.;Furuzono S. et al.;Hatano N. et al.;Aoyama M. et al.;Takai N. et al.
• 通讯作者: Takai N. et al.

Two arginines in C-termines domain are essential for the voltage-dependent regulation of A-type K^+ current in the Kv4 channel

C 端结构域中的两个精氨酸对于 Kv4 通道中 A 型 K^ 电流的电压依赖性调节至关重要

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Biological Chemistry 279
• 作者: Liu H.-N.et al.;Liu H.-N.et al.;Furuzono S. et al.;Hatano N. et al.
• 通讯作者: Hatano N. et al.

Muraki K. et al.: "Effects of KRN4884, a novel K^+ channel opener, on ionic currents in rabbit femoral arterial myocytes"Journal of Pharmacological Sciences. 93(3). 289-298 (2003)

Muraki K.等人：“KRN4884（一种新型K + 通道开放剂）对兔股动脉肌细胞离子电流的影响”药理学科学杂志。