オルガネラ間相互作用による出芽酵母液胞膜イオンチャネルの活性化機構の研究

通过细胞器间相互作用研究出芽酵母液泡膜离子通道的激活机制

• 批准号: 22K05425
• 负责人: 浜本 晋
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05425/
• 关键词: 出芽酵母; 浸透圧応答; イオンチャネル; オルガネラ膜; 電気生理学; イオン輸送体; 液胞; ミトコンドリア; オルガネラ間相互作用

TRPチャネルは、環境変化に応答する陽イオンチャネルとして多くの真核生物に保存されている。出芽酵母のホモログであるTRPY1は液胞膜に発現して細胞外の浸透圧変化に応答して液胞から細胞質にCa2+を放出しているが、その浸透圧変化を感知する分子機構は不明である。本研究では、TRPY1による高浸透圧応答に関わる制御因子の同定を目的に、出芽酵母の一遺伝子破壊株コレクション5100株にイクオリン遺伝子を導入してCa2+の発光検出を行った。その結果、43株において高浸透圧ストレス応答に変化が観察された。さらに、43株において破壊されている遺伝子を野生株よりクローニングし、出芽酵母に過剰発現させたところ、7つの遺伝子発現株において野生株よりも高い高浸透圧応答活性が示された。本研究では、イクオリンアッセイによる細胞内Ca2+の検出、タンパク質相互作用、電気生理学的解析手法の一つであるパッチクランプ法を用いてTRPY1のイオンチャネル活性の測定を行い、これらの候補制御因子によるTRPY1の活性制御機構の解明を目指す。多くのオルガネラはサイズが小さいことからパッチクランプ法の適用が難しい。そのため、オルガネラ膜局在性イオンチャネルの研究は遅れている。出芽酵母の液胞は比較的大きいことからパッチクランプ法の適用が可能であり、これまでに幾つかのイオンチャネル活性の測定に成功している。本研究では、オルガネラ膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に局在化させるシグナル配列の開発を行い、出芽酵母液胞膜を用いた機能解析系の構築を目指している。前年度までに見出したシグナル配列（X18タグ）の付加により、チラコイド膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に発現させることに成功しているが、未だ多くのイオン輸送体においては液胞膜への局在化が達成されていない。本年度以降の研究においてシグナル配列の改良を行う。

TRP production, environmental protection, and conservation TRPY1 is responsible for the development of intracellular membrane, extracellular osmotic pressure, intracellular Ca2 + release, and intracellular osmotic pressure sensing. In this study, TRPY1 was used to control the induction of Ca2 + in 5100 strains of budding yeast. The results showed that 43 strains were highly permeable to water. In addition, 43 strains were isolated from wild strains, and budding yeast was developed from wild strains. 7 strains were isolated from wild strains and showed high permeability. In this study, the intracellular Ca2 + production, plasma interaction, electrophysiological analysis methods, the determination of TRPY1 activity, and the interpretation of TRPY1 activity control mechanisms for candidate control factors were studied. It is difficult to apply the method of multi-color reproduction. The research on the relationship between the two groups was carried out in the paper. It is possible to determine the cell activity of budding yeast by using the method of cell culture. In this study, the development of cell alignment and the construction of functional analysis system of budding yeast cell membrane were pointed out. In the past year, it has been found that the transfer of protein and protein (X18) has been successfully carried out in the development of budding yeast cell membrane. This year, we will conduct research on the improvement of the structure of the plant.