オルガネラ間相互作用による出芽酵母液胞膜イオンチャネルの活性化機構の研究

通过细胞器间相互作用研究出芽酵母液泡膜离子通道的激活机制

• 批准号: 22K05425
• 负责人: 浜本 晋
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05425/
• 关键词: 出芽酵母; 浸透圧応答; イオンチャネル; オルガネラ膜; 電気生理学; イオン輸送体; 液胞; ミトコンドリア; オルガネラ間相互作用

TRPチャネルは、環境変化に応答する陽イオンチャネルとして多くの真核生物に保存されている。出芽酵母のホモログであるTRPY1は液胞膜に発現して細胞外の浸透圧変化に応答して液胞から細胞質にCa2+を放出しているが、その浸透圧変化を感知する分子機構は不明である。本研究では、TRPY1による高浸透圧応答に関わる制御因子の同定を目的に、出芽酵母の一遺伝子破壊株コレクション5100株にイクオリン遺伝子を導入してCa2+の発光検出を行った。その結果、43株において高浸透圧ストレス応答に変化が観察された。さらに、43株において破壊されている遺伝子を野生株よりクローニングし、出芽酵母に過剰発現させたところ、7つの遺伝子発現株において野生株よりも高い高浸透圧応答活性が示された。本研究では、イクオリンアッセイによる細胞内Ca2+の検出、タンパク質相互作用、電気生理学的解析手法の一つであるパッチクランプ法を用いてTRPY1のイオンチャネル活性の測定を行い、これらの候補制御因子によるTRPY1の活性制御機構の解明を目指す。多くのオルガネラはサイズが小さいことからパッチクランプ法の適用が難しい。そのため、オルガネラ膜局在性イオンチャネルの研究は遅れている。出芽酵母の液胞は比較的大きいことからパッチクランプ法の適用が可能であり、これまでに幾つかのイオンチャネル活性の測定に成功している。本研究では、オルガネラ膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に局在化させるシグナル配列の開発を行い、出芽酵母液胞膜を用いた機能解析系の構築を目指している。前年度までに見出したシグナル配列（X18タグ）の付加により、チラコイド膜局在性イオンチャネルを出芽酵母液胞膜に発現させることに成功しているが、未だ多くのイオン輸送体においては液胞膜への局在化が達成されていない。本年度以降の研究においてシグナル配列の改良を行う。

TRP environmental protection and environmental protection response to eukaryote conservation. Saccharomyces cerevisiae cell membrane test showed that the extracellular membrane of the yeast was soaked, the Ca2+ was released from the cell, and the molecular mechanism was unknown. In this study, TRPY1 and TRPY1 were used to answer the question that the control factors were the same as those of Saccharomyces cerevisiae. 5100 strains of yeast were isolated from Saccharomyces cerevisiae. The results showed that 43 strains were highly permeable. The wild plants were isolated, 43 strains were isolated, the wild plants were isolated, the budding yeast was detected, and the wild plants were isolated from the wild plants with high concentration and high permeability. In this study, the intracellular Ca2+ emission, interaction, and the analytical method of computer physiology were used to determine the activity of Ca2+ and TRPY1 in the laboratory by using the analytical method of computer physiology. There is a lot of trouble in the use of the method. The film bureau is in the process of studying the situation. The activity of Saccharomyces cerevisiae was determined successfully by using the method of liquid cell ratio. In this study, the cell membrane of sprouting yeast was used to analyze the cell membrane of sprouting yeast. In the previous year, the system was installed (X18). In the previous year, the production of yeast sprouts was detected in the Saccharomyces cerevisiae sprouting cell membrane in the previous year. This year, we will conduct a study on the allocation of "improved" lines.