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封入体形成を抑制する低温タンパク質生産システムの開発

开发抑制包涵体形成的低温蛋白质生产系统

基本信息

批准号：
16658044
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、生態系の理解や未知遺伝子資源の開拓を目的として、環境ゲノム情報が急速に明らかにされつつある。地球上の生物圏の80%以上が深海や極地等の低温環境であることを考えると、環境ゲノムがコードするタンパク質の多くが熱安定性の低い低温活性タンパク質であると推測される。低温活性タンパク質の多くは、大腸菌等を宿主とした常温での発現系では生産が難しい。そこで本研究では、南極海水より単離された低温菌Shewanella libingstonensis Ac10を宿主とし、低温でタンパク質を生産する系の開発を行った。本菌の最適増殖温度は18℃であるが、4℃でも良好に生育する。我々は本菌の全ゲノム配列をほぼ明らかにしており、ゲノム情報に基づいた生産系の構築・改良が可能である。まず、本菌を宿主として複製するコスミドベクターを見いだし、形質転換法を確立した。さらに、本菌のタンパク質を二次元電気泳動で解析し、高生産されているものを同定した。そのプロモーターを上記ベクターに組み込んで発現ベクターを構築した。本生産系の有用性を確かめるため、好冷菌Desulfotalea psychrophila由来の酵素タンパク質の生産を行った。D. psychrophilaは至適温度10℃の好冷菌であり、その保持するタンパク質の多くが熱に不安定であると推測される。そこでD.psychrophila由来のoligoendopeptidase, aminopeptidase, prolidase, β-glucosidaseを18℃で発現させた。その結果、4種類とも可溶性タンパク質として高生産された。prolidaseとβ-glucosidaseについては、大腸菌を宿主とした場合、低温(18℃)で培養しても、ほとんど生産されなかった。以上の結果から、本生産系が低温環境由来等の熱安定性の低いタンパク質の生産に適していることが示唆された。

In recent years, the understanding of ecosystems, the development of unknown genetic resources, and the rapid development of environmental information have been highlighted. More than 80% of the Earth's biosphere has a low temperature environment, such as deep sea and polar regions. Low temperature activity of many kinds of bacteria, such as Escherichia coli host and normal temperature development system is difficult to produce. In this study, the development of a system for the production of low-temperature bacteria Shewanella libingstonensis Ac10 in Antarctic seawater was carried out. The optimum growth temperature of this strain is 18℃ and 4℃. We have a complete set of bacteria, which can be used to construct and improve the production system. The host and host of the bacteria are replicated in the medium and the physical transformation method is established In the meantime, the quality of the bacteria is analyzed by two-dimensional electrokinetic analysis, and the production is stable. The first step is to create a new structure for the first time. The utility of this production system is confirmed by the production of enzyme from Desulfotalea psychrophila. D. Psychrophila is not stable at temperatures up to 10℃. D. psychophila is produced by oligoendopeptide, aminopeptide, proliidase, β-glucosidase at 18℃. The results are as follows: 4 kinds of soluble substances are produced in high yield. Prolidase and β-glucosidase are used in culture, production and low temperature (18℃). As a result, this production system has low thermal stability due to low temperature environment, etc.