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微生物のハロ酸デハロゲナーゼの分子生物学的研究と応用

微生物卤酸脱卤酶的分子生物学研究及应用

基本信息

批准号：
05760069
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲンを触媒する2-ハロ酸デハロゲナーゼ(DEX)には立体特異性が異なる4種(L-DEX、D-DEX、DL-DEX(立体保持型)、DL-DEX(立体反転型))が知られている。このうち、L-DEX、DL-DEX(立体反転型)の構造と機能を解析した。1.土壌細菌PseudomonasspYLからL-DEXを精製し、これが高い耐熱性を有していること、また、有機溶媒中、炭素鎖長16の長鎖の基質にも作用することを明らかにした。同じ菌株が生産するDL-DEX(立体反転型)の精製及び諸性質の検討も行った。2.L-DEX遺伝子の塩基配列を決定した。翻訳領域は696塩基からなり、232アミノ酸をコードしていた。これは他生物由来のL-DEX及びハロ酢酸デハロゲナーゼと38-57%の高い相同性を示した。一方、立体特異性を異にするD-DEXや、基質特異性を異にするハロアルカンデハロゲナーゼとは有意な相同性はなかった。3.クローン化したL-DEX遺伝子を、Escherichia coliJM109に導入し、全可溶蛋白質の約50%という非常に高い効率で本酵素を生産する組換え体を得た。この組換え体から、熱処理とイオン交換クロマトグラフィーのみで簡便に本酵素を均一に精製する方法を確立した。4.3.で大量に精製した酵素を用い、15%PEG8000、1%n-プロパノールを沈殿剤として、良質な結晶を得ることができた。:5.L-DEXはAsp,Gluの化学修飾で失活した。他生物由来のL-DEXとの間で完全に保存されている5箇所のAsp、1箇所のGluを部位特異的変異法により、Asn、Glnにそれぞれ改変した。その結果、10位及び180位のAsp残基を改変した変異酵素において著しい活性低下が認められ、これらの触媒反応への関与が示唆された。

4 kinds of stereospecificity (L-DEX, D-DEX, DL-DEX(stereo-maintaining type), DL-DEX (stereo-inverse type)) are known. The structure and function of L-DEX, DL-DEX(stereo inverse type) are analyzed. 1. The bacteria Pseudomonas spYL and L-DEX are highly resistant to heat, organic solvents, and carbon chains. The purification of DL-DEX(stereo inverse type) and the study of various properties of the same strain were carried out. 2.L-DEX gene base alignment decision The number of Internet users has increased to 696 million, with 232 million users. The high similarity between L-DEX and L-DEX is 38-57%. A party, stereospecificity, D-DEX, stroma specificity, intentional identity 3. About 50% of total soluble protein was introduced into Escherichia coli JM109 and the enzyme was produced at a very high efficiency. The method of uniform purification of the enzyme was established by simple and convenient method of composition and heat treatment. 4.3. A large number of refined enzymes are used, 15% PEG8000, 1% n-p-p 5. Chemical modification of L-DEX with Asp,Glu inactivates it. 5 Asp, 1 Glu, site-specific variation of L-DEX, Gln, Glu, Glu, As a result, Asp residues at positions 10 and 180 were modified to reduce the activity of the enzyme.