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フルオロ酢酸デハロゲナーゼによる炭素-フッ素結合の切断機構

氟乙酸脱卤酶裂解碳氟键的机制

基本信息

批准号：
08760080
负责人：
栗原達夫
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Moraxella sp.B由来のフルオロ酢酸デハロゲナーゼH-1は各種ハロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、グルコール酸を生成する酵素であり炭素-フッ素結合の加水分解的開裂を触媒できる唯一の酵素である。本研究では、環境浄化等に有用なデハロゲナーゼの分子設計を行うことを目標に、本酵素の触媒機構と触媒中心残基の役割を検討した。ハロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応の機構としては、酸性アミノ酸残基の側鎖カルボキシル基の求核攻撃によって生成するエステル中間体を経由するものと、塩基性残基に活性化された水分子が基質を直接攻撃するものとの2つが考えられる。本研究では、エステル中間体経由の反応を触媒する既知の酵素との比較から、本酵素においてそれぞれ求核残基、水分子活性化残基、ハロゲン引き抜き残基に対応すると推測されたAsp105、His272、Arg106の機能を解析した。まずH_2^<18>O中で反応を行った野生型酵素をトリプシンで分解し、Asp105を含むペプチド断片をタンデムMS/MS法で分析したところ、Asp105に^<18>Oが取り込まれていた。また本酵素は、基質共存下で、水分子よりも強い求核性をもつヒドロキシルアミンと濃度依存的な失活を起こした。一方、H272N変異酵素を基質と反応させると酵素の分子量が約58増加し、^<14>C標識した基質と反応させると酵素分子に放射活性の取り込みが見られた。またArg106の変異により基質特異性が変化した。以上の結果、本酵素反応では、まずAsp105の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を求核攻撃してハライドイオンが脱離し、次いで、酵素と基質からなるエステル中間体が溶媒の水分子によって加水分解されると考えられた。そして、水分子の活性化にはHis272の、ハロゲン引き抜きにはArg106の関与がそれぞれ示唆された。

Moraxella sp.B is derived from the enzyme H-1, which catalyzes the hydrolysis of various acetic acids. The enzyme H-1 is the only enzyme that catalyzes the hydrolysis of carbon-tin bonds. In this study, we investigated the molecular design of the enzyme and its catalytic mechanism. The mechanism of hydrolysis of acetic acid is discussed in detail below. The mechanism of hydrolysis of acetic acid is discussed in detail below. In this study, we compared and analyzed the functions of the known enzymes in the reaction between the two enzymes, including nuclear residues, water molecule activating residues, and amino acid residues, Asp105, His272, and Arg106. The <18>wild-type enzyme in H_2^ O was analyzed by MS/MS method<18>. This enzyme is activated by a concentration-dependent inactivation of the enzyme due to the presence of water molecules in the substrate. The molecular weight of the enzyme was increased by about 58%, and the activity of the enzyme molecule was increased by about 272%<14>. Also, the change in Arg106 changes the substrate specificity. As a result, the enzyme reaction was characterized by the presence of Asp105 in the side chain, the presence of α-carbon in the substrate, and the presence of an intermediate in the substrate. The activation of water molecules is related to His272 and Arg106.