Dissection of the molecular basis of membrane vesicle biogenesis and construction of an extracellular platform for substance production by using a hyper-vesiculating bacterium

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【細胞外膜小胞形成を担う分子基盤の解明】前年度に引き続き、細胞外膜小胞高生産性細菌 Shewanella vesiculosa HM13 の膜小胞生産に関与する因子を、トランスポゾンランダム変異導入によって探索した。10,100 株のトランスポゾン変異株の膜小胞生産性を、曲率認識ペプチドを用いたハイスループットな手法によって評価し、生産性が顕著に変化した変異株についてトランスポゾン挿入箇所を解析した。その結果、18 種の高生産変異株と 8 種の低生産変異株について、トランスポゾン挿入箇所を同定することに成功した。同定した一部の遺伝子について、相同組換えによる破壊株と相補株を作製し、ナノ粒子軌跡解析で膜小胞生産量を定量した。その結果、LapG プロテアーゼなどの欠失が膜小胞生産性を高めることや、D-ヘキソース-6-リン酸エピメラーゼなどの欠失が膜小胞生産性を低下させることが見出された。【膜小胞へのタンパク質積み込み機構の解析】S. vesiculosa HM13 の膜小胞の主要積荷タンパク質 P49 は、膜小胞表層多糖と結合することが示唆されている。P49 遺伝子近傍には表層糖鎖合成の初発反応を触媒する WecA の N 末端領域と C 末端領域のホモログをコードする wecA3N と wecA3C が存在する。本菌は、これらの他に WecA ホモログをコードする wecA1 と wecA2 も有する。これらがコードする三種の WecA ホモログの単独欠損株や二重欠損株では表層多糖生合成や P49 の膜小胞への積み込みが認められたのに対し、これらをすべて欠損させた三重欠損株では、膜小胞から表層多糖と P49 が消失した。以上の結果から、三種の WecA ホモログには機能重複があり、これらに依存して生合成される膜小胞表層多糖が P49 との結合性を有すると考えられた。