細胞表面に局在する受容体分子数の人為的調節に向けた基礎的技術開発

細胞表面受容体の過剰な活性発現は、細胞の癌化や高血圧症など種々の病態の原因になっており、従来薬物治療の標的として注目されてきた。本研究は、疾病にかかわる特定の受容体の局在性や総量を、受容体ソーティングの機能を利用し人為的に調節することを目的とした。すなわち、受容体内在化のトリガーになる可能性を持つタンパク質を細胞の内部から当該受容体にターゲティングさせ、受容体分子を強制的に内在化させる事を試みた。モデル受容体としては、チロシンキナーゼ活性を持つErbB2受容体と、Gタンパク質共役型受容体である1型アンジオテンシンII受容体を使用した。1.予備実験として、ErbB2受容体の内在化を促進すると考えられるcblと受容体分子との融合タンパク質を培養細胞系で発現させた。融合タンパク質の細胞内局在を蛍光抗体法により観察したところ、細胞表面発現が減少し、細胞内にエンドソームに一致する当該タンパク質の凝集像が認められ、受容体分子の細胞内ソーティングに影響を与えていることが確認された。2.ErbB2受容体、および1型アンジオテンシンII受容体の細胞質内ドメインを大腸菌で発現させ、マウス腹腔に投与免疫した。免疫血清を用いたウエスターン法により、良好な特異的抗体の産生を確認した。3.免疫マウスの脾臓からRNAを精製し、抗体遺伝子cDNAをRT-PCR法にて合成増幅し、ファージディスプレイ法を利用し、一本鎖抗体をファージ表面に発現するライブラリーを作成した。4.一本鎖抗体発現ファージライブラリーから、受容体細胞質内ドメインと反応するクローンの分離を試みたが成功に至っていない。そのため、免疫マウスの脾臓を利用し、受容体細胞質内ドメインに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを作成し、その特異的抗体遺伝子から一本鎖抗体を作成すべく、実験を継続中である。

細胞表面受容体の過剰な活性発現は、細胞の癌化や高血圧症など種々の病態の原因になっており、従来薬物治療の標的として注目されてきた。本研究は、疾病にかかわる特定の受容体の局在性や総量を、受容体ソーティングの機能を利用し人為的に調節することを目的とした。すなわち、受容体内在化のトリガーになる可能性を持つタンパク質を細胞の内部から当該受容体にターゲティングさせ、受容体分子を強制的に内在化させる事を試みた。モデル受容体としては、チロシンキナーゼ活性を持つErbB2受容体と、Gタンパク質共役型受容体である1型アンジオテンシンII受容体を使用した。1.予備実験として、ErbB2受容体の内在化を促進すると考えられるcblと受容体分子との融合タンパク質を培養細胞系で発現させた。融合タンパク質の細胞内局在を蛍光抗体法により観察したところ、細胞表面発現が減少し、細胞内にエンドソームに一致する当該タンパク質の凝集像が認められ、受容体分子の細胞内ソーティングに影響を与えていることが確認された。2.ErbB2受容体、および1型アンジオテンシンII受容体の細胞質内ドメインを大腸菌で発現させ、マウス腹腔に投与免疫した。免疫血清を用いたウエスターン法により、良好な特異的抗体の産生を確認した。3.免疫マウスの脾臓からRNAを精製し、抗体遺伝子cDNAをRT-PCR法にて合成増幅し、ファージディスプレイ法を利用し、一本鎖抗体をファージ表面に発現するライブラリーを作成した。4.一本鎖抗体発現ファージライブラリーから、受容体細胞質内ドメインと反応するクローンの分離を試みたが成功に至っていない。そのため、免疫マウスの脾臓を利用し、受容体細胞質内ドメインに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを作成し、その特異的抗体遺伝子から一本鎖抗体を作成すべく、実験を継続中である。