歯周病原性細菌におけるタンパク質の新規膜透過システムの解明

歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalis(P.g.)の産生する2つのシステインプロテアーゼRgpとKgpは歯周疾患の発症および進行に重要な役割をしていると考えられている。これら2つの酵素はプロテアーゼドメインと血球凝集素ドメインの2つの機能ドメインをもつ構造上類似した酵素である。我々は、前回P.g.内でのKgpの発現法を確立し、Kgpの活性中心は248番目と249番目のシステインが重要であることを明らかとした。今回はまず、非常に大きなC末端血球凝集素ドメインの役割を解析するために、C末端ドメインの長さの異なるプラスミドを作製した。野生型におけるKgpのC末端血球凝集素ドメインは3つのサブドメインに分けられるため、これらプラスミドを欠損変異体に発現させるKgpの長さはそれぞれのサブドメインを参考にした。昨年度のKgpの発現法をもとにP.g.内で安定に維持できるプラスミドpYKP028のKpnI部位に目的の長さのKgp遺伝子を挿入し、まず、大腸菌SM10λpirへ導入した。大腸菌での選別はアンピシリンで行った。これを接合伝達によりKgp欠損変異体へ導入した。ここでの選別はテトラサイクリンを用いた。現在、これらの変異体を解析中であるが、これらの変異体の中で、全遺伝子を含むプラスミドを導入した変異体は活性が非常に弱かった。もしかすると、C末端領域が非常に大きいため、発現効率が下がった可能性も考えられる。今後は、さらに構造解析を進め、血球凝集素ドメインのKgp輸送における役割、およびにプロドメインの役割についても解析を加えていきたい。

歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalis(P.g.)の産生する2つのシステインプロテアーゼRgpとKgpは歯周疾患の発症および進行に重要な役割をしていると考えられている。これら2つの酵素はプロテアーゼドメインと血球凝集素ドメインの2つの機能ドメインをもつ構造上類似した酵素である。我々は、前回P.g.内でのKgpの発現法を確立し、Kgpの活性中心は248番目と249番目のシステインが重要であることを明らかとした。今回はまず、非常に大きなC末端血球凝集素ドメインの役割を解析するために、C末端ドメインの長さの異なるプラスミドを作製した。野生型におけるKgpのC末端血球凝集素ドメインは3つのサブドメインに分けられるため、これらプラスミドを欠損変異体に発現させるKgpの長さはそれぞれのサブドメインを参考にした。昨年度のKgpの発現法をもとにP.g.内で安定に維持できるプラスミドpYKP028のKpnI部位に目的の長さのKgp遺伝子を挿入し、まず、大腸菌SM10λpirへ導入した。大腸菌での選別はアンピシリンで行った。これを接合伝達によりKgp欠損変異体へ導入した。ここでの選別はテトラサイクリンを用いた。現在、これらの変異体を解析中であるが、これらの変異体の中で、全遺伝子を含むプラスミドを導入した変異体は活性が非常に弱かった。もしかすると、C末端領域が非常に大きいため、発現効率が下がった可能性も考えられる。今後は、さらに構造解析を進め、血球凝集素ドメインのKgp輸送における役割、およびにプロドメインの役割についても解析を加えていきたい。