環境微生物の機能遺伝子の視覚的検出

环境微生物功能基因的视觉检测

• 批准号: 17651044
• 负责人: 大橋 晶良
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17651044/
• 关键词: fluorescence in situ hybridization; 細胞壁処理; メタン生成古細菌; tyramide signal amplificatlon; mRNA; two-pass TSA-FISH法; シュードムレイン加水分解酵素

微生物を培養によらずシングルセルかつ特異的に検出可能な技術の1つにFluorescence in situ hybridization(FISH)法がある。rRNAを標的としたFISH法はかなり熟成の域に入ってきたものの、mRNAや遺伝子を標的とした場合、蛍光標識プローブを用いたFISH法では感度が不十分である。そこでより高感度検出が可能な手法としてtyramide signal amplification(TSA)によりシグナル増幅を行うTSA-FISH法がある。しかしながらTSA-FISH法を適用するためには反応を触媒する酵素を菌体内に浸透させる必要がある。しかしながら酵素は非常に大きく、通常の固定だけでは菌体内への浸透は困難であるため、適切な細胞壁処理技術が必要である。またmRNAや遺伝子はTSA-FISH法を用いたとしても十分な感度が得られず、信頼のおける検出は困難である。そこでより高感度な検出技術の開発も試みた。細胞壁処理技術についてはこれまでに知見の得られていないメタン生成古細菌に着目し、検討を行った。その結果シュードムレイン加水分解酵素PeiWを細胞壁処理技術の1つとして提案できる結果が得られた。しかしながらこの処理技術ではメタン生成古細菌を網羅的に検出できないため、更なる検討が必要である。また高感度化としてtwo-pass TSA-FISH法を原核生物に適用するための最適化を行った。その結果TSA-FISH法では検出できなかったmRNAを、本技術を用いることで検出に成功した。本研究から得られた知見は、微生物の機能を培養によらず推定するための重要な技術基盤になると考えられる。今後はより多くの微生物種にTSA-FISH法を適用するための処理技術の開発とともに、微生物染色体に保存されている遺伝子を検出するためのtwo-pass TSA-FISH法の最適化が課題である。

Microbial を culture によらずシ <s:1> グ グ <s:1> セ セ セ に検 specific に検 possible な techniques <s:1> 1 に にFluorescence in situ hybridization(FISH) がある. RRNA を mark と し た FISH method は か な り ripening の domain に into っ て き た も の の, mRNA や heritage 伝 を son mark と し た occasions, 蛍 light logo プ ロ ー ブ を with い た FISH method で は sensitivity が not quite で あ る. そ こ で よ り 検 Gao Gan degrees out が may な gimmick と し て tyramide signal amplification (TSA) に よ り シ グ ナ ル raised line of を う TSA - FISH method が あ る. し か し な が ら TSA - FISH を applicable す る た め に は anti 応 を catalyst す を る enzyme bacteria in vivo に soak さ せ る necessary が あ る. し か し な が ら enzyme は very big に き く, usually の fixed だ け で は bacteria in vivo へ の soak は difficult で あ る た め, the cell walls of adequate な 処 technology が necessary で あ る. ま た mRNA や posthumous son 伝 は を TSA - FISH method with い た と し て も very が な sensitivity to ら れ ず, letter 頼 の お け る 検 out は difficult で あ る. Youdaoplaceholder0 そ でよ でよ そ high-sensitivity な検 technology <s:1> development pilot みた. Cell wall 処 manage technology に つ い て は こ れ ま で に knowledge の have ら れ て い な い メ タ ン generated the archaea に line with し, beg を 検 っ た. そ の results シ ュ ー ド ム レ イ ン hydrolysis enzyme PeiW を cell 1 処 manage technology の つ と し て proposal で き る results ら が れ た. し か し な が ら こ の 処 manage technology で は メ タ ン generates the archaea を snare に 検 out で き な い た め, more な る beg が 検 necessary で あ る. Youdaoplaceholder0 hypersensitivity と て てtwo-pass TSA-FISH method を prokaryotes に applicable するため <s:1> optimization を row った Results そ の TSA - FISH method で は 検 out で き な か っ た mRNA を, this technical を い る こ と で 検 に successful し た. This study か ら have ら れ た knowledge は, microbial の functional を cultivate に よ ら ず presumption す る た め の important な technology base plate に な る と exam え ら れ る. More than the next は よ り く の microbial species に TSA - FISH を applicable す る た め の 処 manage technology の open 発 と と も に, microbial chromosome に save さ れ て い る heritage 伝 son を 検 out す る た め の method of two - pass the TSA - FISH の optimization が subject で あ る.

项目成果

two-pass CARD-FISH法によるシングルコピー遺伝子の検出

二次CARD-FISH法检测单拷贝基因

• 发表时间: 2006
• 期刊: 第40回日本水環境学会年会講演集
• 作者: 川上周司;久保田健吾;井町寛之;大橋晶良;原田秀樹
• 通讯作者: 原田秀樹

CARD-FISH for Detection of Functional Gene of Methanogens.

用于检测产甲烷菌功能基因的 CARD-FISH。

• 发表时间: 2005
• 期刊: The ASM 105th General Meeting Proceedings
• 作者: Kubota;K;A.Ohashi;H.Imachi;H.Harada
• 通讯作者: H.Harada

Two-pass TSA-FISH法による微生物genome上のシングルコピー遺伝子の検出

二次 TSA-FISH 方法检测微生物基因组上的单拷贝基因

• 发表时间: 2005
• 期刊: 第60回土木学会全国大会講演集 (CD-ROM)
• 作者: 久保田健吾;大橋晶良;井町寛之;原田秀樹
• 通讯作者: 原田秀樹

DNAを標的としたFISHプローブの特異性評価法

靶向DNA的FISH探针特异性评估方法

• 发表时间: 2005
• 期刊: 第23回土木学会新潟会講演集
• 作者: 川上周司;久保田健吾;井町寛之;大橋晶良;原田秀樹
• 通讯作者: 原田秀樹

Visualization of mcr mRNA in a methanogen by fluorescence in situ hybridization with an oligonucleotide probe and two-pass tyramide signal amplification (two-pass TSA-FISH)

• DOI: 10.1016/j.mimet.2006.02.002
• 发表时间: 2006-09-01
• 期刊: JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS
• 影响因子: 2.2
• 作者: Kubota, Kengo;Ohashi, Akiyoshi;Harada, Hideki
• 通讯作者: Harada, Hideki