環境微生物の機能遺伝子の視覚的検出

微生物を培養によらずシングルセルかつ特異的に検出可能な技術の1つにFluorescence in situ hybridization(FISH)法がある。rRNAを標的としたFISH法はかなり熟成の域に入ってきたものの、mRNAや遺伝子を標的とした場合、蛍光標識プローブを用いたFISH法では感度が不十分である。そこでより高感度検出が可能な手法としてtyramide signal amplification(TSA)によりシグナル増幅を行うTSA-FISH法がある。しかしながらTSA-FISH法を適用するためには反応を触媒する酵素を菌体内に浸透させる必要がある。しかしながら酵素は非常に大きく、通常の固定だけでは菌体内への浸透は困難であるため、適切な細胞壁処理技術が必要である。またmRNAや遺伝子はTSA-FISH法を用いたとしても十分な感度が得られず、信頼のおける検出は困難である。そこでより高感度な検出技術の開発も試みた。細胞壁処理技術についてはこれまでに知見の得られていないメタン生成古細菌に着目し、検討を行った。その結果シュードムレイン加水分解酵素PeiWを細胞壁処理技術の1つとして提案できる結果が得られた。しかしながらこの処理技術ではメタン生成古細菌を網羅的に検出できないため、更なる検討が必要である。また高感度化としてtwo-pass TSA-FISH法を原核生物に適用するための最適化を行った。その結果TSA-FISH法では検出できなかったmRNAを、本技術を用いることで検出に成功した。本研究から得られた知見は、微生物の機能を培養によらず推定するための重要な技術基盤になると考えられる。今後はより多くの微生物種にTSA-FISH法を適用するための処理技術の開発とともに、微生物染色体に保存されている遺伝子を検出するためのtwo-pass TSA-FISH法の最適化が課題である。

微生物を培養によらずシングルセルかつ特異的に検出可能な技術の1つにFluorescence in situ hybridization(FISH)法がある。rRNAを標的としたFISH法はかなり熟成の域に入ってきたものの、mRNAや遺伝子を標的とした場合、蛍光標識プローブを用いたFISH法では感度が不十分である。そこでより高感度検出が可能な手法としてtyramide signal amplification(TSA)によりシグナル増幅を行うTSA-FISH法がある。しかしながらTSA-FISH法を適用するためには反応を触媒する酵素を菌体内に浸透させる必要がある。しかしながら酵素は非常に大きく、通常の固定だけでは菌体内への浸透は困難であるため、適切な細胞壁処理技術が必要である。またmRNAや遺伝子はTSA-FISH法を用いたとしても十分な感度が得られず、信頼のおける検出は困難である。そこでより高感度な検出技術の開発も試みた。細胞壁処理技術についてはこれまでに知見の得られていないメタン生成古細菌に着目し、検討を行った。その結果シュードムレイン加水分解酵素PeiWを細胞壁処理技術の1つとして提案できる結果が得られた。しかしながらこの処理技術ではメタン生成古細菌を網羅的に検出できないため、更なる検討が必要である。また高感度化としてtwo-pass TSA-FISH法を原核生物に適用するための最適化を行った。その結果TSA-FISH法では検出できなかったmRNAを、本技術を用いることで検出に成功した。本研究から得られた知見は、微生物の機能を培養によらず推定するための重要な技術基盤になると考えられる。今後はより多くの微生物種にTSA-FISH法を適用するための処理技術の開発とともに、微生物染色体に保存されている遺伝子を検出するためのtwo-pass TSA-FISH法の最適化が課題である。