微生物機能遺伝子の発現を視覚化する-FISH法の超高感度化と細胞処理技術の開発-

微生物功能基因表达可视化 - 超高灵敏度FISH方法和细胞处理技术的开发 -

• 批准号: 19656133
• 负责人: 大橋 晶良
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19656133/
• 关键词: 原核生物; 機能遺伝子; 分子生物学的手法; FISH法; シングルセル解析; 未培養微生物群; 細胞壁処理

本研究では、微生物に高感度two-pass TSA-FISH法を適用するため、次のような開発と検討を行った。1)mRNA及び遺伝子を検出するための高感度two-pass TSA-FISH⇒の開発存在数の少ない標的を検出するために、シグナル増幅法であるTSA法を二度繰り返すtwo-pass TSA-FISH法の開発を行い、mRNAの可視化に成功した。しかし、スライド上において菌体以外からの非特異高なバックグラウンドが増大するという問題に直面した。これは従来のFISH法では問題にならず、高感度な本手法の特有の問題であると思われる。そこで、全ての反応をチューブ内で行うように方法を変更したところ、非特異的なバックグラウンドの抑制に成功した。これにより若干の計画変更が生じたが、開発することができた。2)高分子なHRP酵素を細⊃内に浸透させるための細⊃壁処理方⇒の険討嫌気発酵リアクター汚泥内のメタン生成古細菌に対し、高感度FISH法を適用するための検討を行った。その結果、メタン生成古細菌は多様な細胞壁構造を有しており、個別の酵素処理を必要とすることがわかった。しかし、シュードムレイン自己分解酵素を用いることで、すべての細胞壁にある程度の処理効果があることがわかり、汎用性の高い処理方法の知見を得ることができた。3)高交雑効率をOする人工核酸プローブの原核生物への適N高交雑効率を有する人工核酸プローブが本手法に適用可能か検討したところ、標的の存在数が低くてもプローブが標的に十分に結合できることがわかった。また、人工核酸塩基の挿入位置やミスマッチに対する影響について検討し、環境サンプルについても適用可能であった。

This study で は, microbial に Gao Gan degree of two - pass the TSA - FISH を applicable す る た め, の よ う な open 発 と 検 line for を っ た. 1) mRNA and び survived 伝 son を 検 out す る た め の Gao Gan degree of two - pass the TSA - FISH ⇒ の less open 発 exist several の な い mark を 検 out す る た め に, シ グ ナ ル raised amplitude method で あ る TSA method を second Qiao り return す two - pass The TSA-FISH method <s:1> developed を rows of を, and mRNA <s:1> visualization に was successful <s:1> た. On し か し, ス ラ イ ド に お い て bacteria outside か ら の nonspecific high な バ ッ ク グ ラ ウ ン ド が raised large す る と い う problem に face し た. <s:1> れ 従 従 従 is used to address the issues of the FISH method で で にならず and the high sensitivity な, which are unique to this technique であると thinking われる. そ こ で, whole て の anti 応 を チ ュ ー ブ で line within う よ う を に method - more し た と こ ろ, nonspecific な バ ッ ク グ ラ ウ ン ド の inhibit に successful し た. A number of <s:1> plans will be updated が to じたが and developed する た とがで た た た た た た. 2) polymer な を HRP enzyme in fine ⊃ に soak さ せ る た め の thin wall 処 ⊃ the principle party ⇒ の 険 (気 発 leaven リ ア ク タ ー sludge in の メ タ ン generated the archaea に し seaborne, Gao Gan FISH を applicable す る た め の 検 line for を っ た. そ の results, メ タ ン generated the archaea は others more な を cell wall structure have し て お り, individual の enzyme 処 を necessary と す る こ と が わ か っ た. し か し, シ ュ ー ド ム レ イ ン their decomposition enzyme を い る こ と で, す べ て の cell wall に あ る degree の 処 Richard unseen fruit が あ る こ と が わ か り, high domestic sex の い 処 method の know see を happily る こ と が で き た. 3) high 雑 sharper rate を O す る artificial nucleic acid プ ロ ー ブ の prokaryotes へ の optimum N 雑 is high working rate を have す る artificial nucleic acid プ ロ ー ブ が this gimmick に is possible か beg し 検 た と こ ろ, low mark の exist several が く て も プ ロ ー ブ に が mark very に combining で き る こ と が わ か っ た. ま た, artificial nucleic acid salt base の scions into position や ミ ス マ ッ チ に す seaborne る influence に つ い て beg し 検, environmental サ ン プ ル に つ い て も may apply で あ っ た.

项目成果

微生物の機能遺伝子をシングルコピーで検出する高感度TSA-FISH法の開発

开发检测微生物中单拷贝功能基因的高灵敏度 TSA-FISH 方法

• 发表时间: 2007
• 作者: 川上周司;久保田健吾;井町寛之;山口隆司;原田秀樹;大橋晶良
• 通讯作者: 大橋晶良

Two-pass TSA-FISH法によるシングルセルレベルでの機能遺伝子の特異的検出

二次TSA-FISH法在单细胞水平特异性检测功能基因

• 发表时间: 2007
• 作者: 川上周司;久保田健吾;井町寛之;山口隆司;原田秀樹;大橋晶良
• 通讯作者: 大橋晶良

In situ visualization of single copy genes at the cellular level by ultra sen sitive two-pass TSA-FISH with oligonucleotide probes

通过使用寡核苷酸探针的超灵敏二次 TSA-FISH 在细胞水平上对单拷贝基因进行原位可视化

• 发表时间: 2007
• 作者: KAWAKAMI S.;KUBOTA K.;IMACHI H.;HARADA H.;YAMAGUCHI T.;OHASHI A.
• 通讯作者: OHASHI A.