酵母出芽の非感染性ウイルス様粒子への遺伝子パッケージングとその遺伝子発現

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1)酵母から産生される非感染性HIV Gag粒子へのゲノムパッケージング系の解析高等真核細胞においては、HIVのゲノムパッケージングはシスパッケージングとトランスパッケージングの2つの方法により可能である。昨年度、Gag蛋白発現plasmidをトランスに供給して非感染性HIV Gag粒子ヘゲノムをパッケージングさせるトランスパッケージング系を酵母細胞で構築した。本年度はまずこの酵母トランスパッケージング系を解析した。HIVの(+)鎖ゲノムは酵母細胞でも極めて選択的に(アクチンmRNAに比べ200-300倍効率よく)Gag粒子へ取り込まれることが判明した。高等真核細胞の場合と同様に、粒子内のHIVゲノムは細胞内のものより不安定でsmearであった。しかしゲノムの2量俗化については検討できなかった。2)一過性発現を目的としたパッケージングユニットの設計DNAワクチンを設計する場合には目的遺伝子の上流にプロモーターを挿入するが、本研究のようにパッケージングされる遺伝子が(+)鎖RNAの場合プロモーターは不要である。むしろ、5'非翻訳領域の下流に挿入する目的遺伝子を効率よく翻訳させるためにはIRES配列が必要であると予測された。そこで、IRES配列の下流にEGFP遺伝子を挿入した発現ユニットを構築した。次に、Gag蛋白発現plasmidを用いてこの発現ユニットとトランスパッケージングさせた非感染性HIV Gag粒子を作製した。現在この発現ユニットパッケージングGag粒子をヒトマクロフアージ系培養細胞にendocytosisにより取り込ませる実験を行なっている。3)細胞性免役誘導が望まれる蛋白質の発現を目的としたパッケージング遺伝子の設計HIV患者へ治療用のブースターワクチンとして考えるならば、結核抗原(Ag85)等も利用価値が高いと期待される。そこで、結核抗原(Ag85)DNAを上記の発現ユニットに組込んだ。