細胞死抑制蛋白による内耳障害の新しい治療法(蛋白治療)の開発

利用细胞死亡抑制蛋白开发内耳疾病的新治疗方法（蛋白质疗法）

基本信息

批准号：
17659527
负责人：
山岨達也
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞死を防御する蛋白質を投与して、内耳障害の予防・治療に応用する蛋白治療を開発した。ミトコンドリアからのチトクロームcの放出を抑えるBcl-XLの三つの水素結合を除去したanti-apoptotic蛋白(FNK)を作成し、これにHIV/Tat蛋白のProtein Transduction Domain(PTD)をくっつけて細胞内に導入できるようにした(FNK-PTD)。まずこの蛋白にmycをtagとして付けたものをモルモットの腹腔内投与し、1-6時間後に断頭し、蝸牛を固定し、パラフィン切片を作成した。その後Myc抗体を用いた免疫染色により蝸牛での発現について検討した。その結果、投与1時間後からこの蛋白は蝸牛内に出現し、3時間後に発現量がピークとなり、6時間後には著明に減少することがわかった。発現部位は、主にコルチ器、ラセン神経節であった。つぎにFNK-PTDが蝸牛有毛細胞の細胞死を予防できるかどうか検討した。カナマイシン((1)200mg/kg、または(2)400mg/kg)およびエタクリン酸((1)40mg/kgまたは(2)50mg/kg)によりモルモットの蝸牛有毛細胞を広範に障害し、この前後にFNK-PTDまたは生食を投与した。1週間後ABRを測定し、断頭後蝸牛を固定し、surface preparationにより残存有毛細胞の数をカウントした。その結果FNK-PTD投与群では(1)および(2)のどちらの障害においても有意にABR閾値の上昇を抑制し、内外有毛細胞ともに有意に細胞死を抑制した。また(2)の条件で障害8時間後にcPARP陽性細胞を調べるとFNK-PTDにより有意に減少していた。この結果はFNK-PTDが蝸牛に発現して、耳毒性薬剤による有毛細胞の細胞死を抑制することを示している。

我们开发了预防细胞死亡的蛋白质，并应用于预防和治疗内耳疾病。抗凋亡蛋白（FNK）是通过去除Bcl-XL的三个氢键来抑制线粒体释放细胞色素c的三个氢键，并将HIV/TAT蛋白蛋白转导域（PTD）连接到此处，以允许引入细胞（FNK-PTD）。首先，将该蛋白与MYC腹膜内施用，作为豚鼠的标签，1-6小时后，将耳蜗固定，并制备石蜡切片。然后通过使用MYC抗体进行免疫染色来检查耳蜗中的表达。结果，发现该蛋白在给药后1小时出现在耳蜗中，在3小时后达到其表达水平，并在6小时后显着降低。表达部位主要是皮尔蒂斯和螺旋神经节。接下来，我们研究了FNK-PTD是否可以防止耳蜗细胞中的细胞死亡。卡纳米霉素（（1）200 mg/kg，或（2）400 mg/kg）和乙烯酸（（（1）40 mg/kg或（2）50 mg/kg）在豚鼠中和后饮食中施用的豚鼠中，在豚鼠中严重受损的耳蜗毛细胞。一周后测量ABR，固定了固定后的耳蜗，并通过表面制备计数剩余的毛细胞数量。结果，在接收FNK-PTD的组中，ABR阈值的升高在疾病（1）和（2）中都受到了显着抑制，并且内部和外毛细胞中的细胞死亡都被显着抑制。此外，当在损伤后8小时检查CPARP阳性细胞（2）时，结果显示出由于FNK-PTD而显着降低。该结果表明，FNK-PTD在耳蜗中表达，并抑制耳毒剂引起的毛细胞死亡。