蝸牛explantを用いた蝸牛有毛細胞死の機序の解明とその予防に関する研究

利用耳蜗外植体阐明耳蜗毛细胞死亡机制及其预防研究

基本信息

批准号：
11877291
负责人：
山岨達也
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877291/
关键词：
培養内耳再生遺伝子治療有毛細胞 Cochlea hair cell apoptosis GDNF gene therapy

项目摘要

成熟モルモットを麻酔・消毒後、滅菌操作で断頭し、側頭骨を摘出、実態顕微鏡下に蝸牛と前庭に分け、CO2インキュベーターに入れて培養した。その後1日-7日間培養し、固定してsurface preparationおよび透過電顕にて観察した。蝸牛においては培養2-3日以内に有毛細胞は死滅し、支持細胞も変性した。ただし、1-2日目の透過電顕の所見ではscar formationが見られ、一部支持細胞表面に有毛のような構造が見られた。前庭では有毛細胞の変性は蝸牛より遅く7日間の培養でも正常に近く保たれた。蝸牛・前庭どちらにおいても神経線維の脱落が培養初期より認められた。はじめはfree radical scavenger等の投与により有毛細胞死の防御を予定していたが、すでに同様の実験での報告がなされたため、この実験系を用いて遺伝子導入が可能か検討した。LacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターを投与し、その発現を見たところ、蝸牛ではmesothelial cell以外に血管条、ラセン神経節、Deiters cellやpillar cellなどの支持細胞、外有毛細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。前庭では有毛細胞および支持細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。今後は神経賦活因子や再生関連遺伝子を組み込んだベクターの投与を行なう予定である。

麻醉和消毒后，通过灭菌将成熟的豚鼠斩首，将颞骨切除，在实际显微镜下分为耳蜗和前庭，并在CO2孵化器中培养。然后将细胞培养1-7天，固定并使用表面制备和透射电子显微镜观察。在耳蜗中，毛细胞在培养后的2-3天内死亡，支持细胞也变性。然而，第1-2天渗透电子显微镜的结果显示出疤痕的形成，一些支撑细胞显示出毛茸茸的结构。在前庭中，即使在培养7天后，毛细胞变性也比在耳蜗中更接近正常。从培养的开始，发现在耳蜗和前庭前庭中，人们发现神经纤维在耳蜗和前庭中丧失。最初，该公司计划通过给予自由基清除剂等保护毛细胞死亡，但是由于已经报道了类似的实验，我们研究了使用该实验系统是否可以进行基因转移。当给腺病毒载体纳入掺入LACZ基因时，除了间皮细胞外，在耳蜗中观察到LacZ基因的表达，在Striae，Leacenic Ganglia，Deiters Ganglia，Deiters细胞和Pillar细胞和支柱细胞等支持细胞中，以及外毛细胞。在毛细胞中观察到LACZ基因的表达，并在前庭区域支撑细胞。将来，我们计划管理包含神经活化因子和再生相关基因的向量。