個体レベルの唾液腺機能解析の為のsiRNAと超音波を応用した遺伝子抑制法の開発

本研究では、in vivoでの遺伝子抑制を個別の臓器で行う技術としてsiRNAと超音波導入法の唾液腺への適応技術を開発することを目指している。モデル動物としてオスのウイスター系ラット(7-9週齢)を用いて実験を行った。昨年度は、1)標的遺伝子の検討、対象としての最適な唾液腺の検討、2)蛍光標識siRNAによる導入効率の検討、3)GAPDHに対するsiRNAによる導入効率の検討を行なった。本年度は、4)超音波照射のパラメータの検討および、5)リポフェクション試薬によるラット唾液腺へのsiRNA導入との比較を行なった。結果;4)超音波照射のパラメータの検討。GAPDHに対するsiRNAを耳下腺導管への逆行性挿管から注入し、超音波強度、照射時間、導入試薬濃度などのパラメータを検討した。照射48時間後に腺体を摘出し、qRT-PCR及びウエスタンブロットによりGAPDH発現量の抑制を観察した。最適なパラメータとして、超音波強度:2,0W/cm^2、照射時間=2分Duty比:50%、併用するマイクロバブル濃度:20%であった。優位な抑制を得るには導入試薬濃度として、1耳下腺あたり16μgのsiRNAを要した。発現抑制はmRNAレベルでは、著明であったが蛋白レベルでは、明らかな抑制は観察できなかった。これは、GAPDHたんぱくの量とライフタイムによると思われた。5)リポフェクション試薬によるラット唾液腺へのsiRNA導入との比較。in vitroでのsiRNA導入に汎用されるリポフェクション法のラット唾液腺へのsiRNA導入効率を検討した。しかし、4)と同様量の16μgのsiRNAに対しin vitroで最適な量のリポフェクション試薬を耳下腺に注入し48時間後に摘出してmRNA量をqRT-PCRにより評価したが、有為な抑制は観られなかった。また、リポフェクション試薬の使用では、耳下腺周囲に著明な炎症反応が観察された。現在、in vivoに使用するリポフェクション試薬量の検討を行なっている。これらの実験結果の一部は、薬理学会総会(平成19年3月14-16日)で発表予定である。また現在、論文を作成中である。

本研究では、in vivoでの遺伝子抑制を個別の臓器で行う技術としてsiRNAと超音波導入法の唾液腺への適応技術を開発することを目指している。モデル動物としてオスのウイスター系ラット(7-9週齢)を用いて実験を行った。昨年度は、1)標的遺伝子の検討、対象としての最適な唾液腺の検討、2)蛍光標識siRNAによる導入効率の検討、3)GAPDHに対するsiRNAによる導入効率の検討を行なった。本年度は、4)超音波照射のパラメータの検討および、5)リポフェクション試薬によるラット唾液腺へのsiRNA導入との比較を行なった。結果;4)超音波照射のパラメータの検討。GAPDHに対するsiRNAを耳下腺導管への逆行性挿管から注入し、超音波強度、照射時間、導入試薬濃度などのパラメータを検討した。照射48時間後に腺体を摘出し、qRT-PCR及びウエスタンブロットによりGAPDH発現量の抑制を観察した。最適なパラメータとして、超音波強度:2,0W/cm^2、照射時間=2分Duty比:50%、併用するマイクロバブル濃度:20%であった。優位な抑制を得るには導入試薬濃度として、1耳下腺あたり16μgのsiRNAを要した。発現抑制はmRNAレベルでは、著明であったが蛋白レベルでは、明らかな抑制は観察できなかった。これは、GAPDHたんぱくの量とライフタイムによると思われた。5)リポフェクション試薬によるラット唾液腺へのsiRNA導入との比較。in vitroでのsiRNA導入に汎用されるリポフェクション法のラット唾液腺へのsiRNA導入効率を検討した。しかし、4)と同様量の16μgのsiRNAに対しin vitroで最適な量のリポフェクション試薬を耳下腺に注入し48時間後に摘出してmRNA量をqRT-PCRにより評価したが、有為な抑制は観られなかった。また、リポフェクション試薬の使用では、耳下腺周囲に著明な炎症反応が観察された。現在、in vivoに使用するリポフェクション試薬量の検討を行なっている。これらの実験結果の一部は、薬理学会総会(平成19年3月14-16日)で発表予定である。また現在、論文を作成中である。