疾患関連蛋白質に対する網羅的一本鎖抗体ライブラリの作製と応用

疾病相关蛋白综合单链抗体库的构建及应用

• 批准号: 18659047
• 负责人: 鎌田 春彦
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: 独立行政法人医薬基盤研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659047/
• 关键词: 一本鎖抗体; ファージ表面提示法; 疾患関連タンパク質; 抗体ライブラリ; プロテオーム; 発現差異解析; メンブランパンニング; 乳がん

一般に遺伝子の機能を具現するのは、複雑な翻訳後修飾を経た最終産物である蛋白質であるため、蛋白質そのものを解析し、疾患の診断や治療に応用する抗体作製技術の確立が待望されている。以上の観点から、本研究では、「数百から数千種類以上もの疾患関連蛋白質の中から医薬品シーズあるいは創薬ターゲットとなる蛋白質を絞り込むための医療薬学的かつ臨床薬学的基盤技術の開発」を目的として、疾患関連蛋白質を認識する抗体を迅速かつ網羅的に作製可能とする技術の開発を行った。そこでまず、あらゆる抗原に対する抗体を含んだナイーブB細胞レセプター遺伝子ライブラリをファージファージ表面に提示させることを目的に、抗原結合領域であるVLとVHドメインをリンカー配列でつなぎ合わせた一本鎖抗体(scFV)をファージに提示させ、Variable region geneからクローニングする技術の開発を行った。その結果、ナイーブB細胞レセプター遺伝子をPCRにて増幅・回収し、ライブラリサイズが2.4×10^9のライブラリサイズを持つ抗体ライブラリの作製に成功した。次に、極微量の疾患関連蛋白質に対するアフィニティパンニング技術の確立を行った。対象疾患としては、乳がんと乳腺に由来する細胞株の発現差異解析を行い、2D-DIGEを用いたタンパク質の分離および発現解析を行い、発現変動の見られる複数のタンパク質スポットを同定することが出来た。さらに、タンパク質を回収し、ウェスタンブロットなどに汎用されるニトロセルロース膜に転写し、パンニング条件の最適化を行った。その結果、僅か100pgという微量の抗原に対しても反応性を持つ一本鎖抗体を得る条件を確立することが出来た。通常、このアフィニティパンニングの操作には、イムノチューブが用いられるが、イムノチューブへの固相化には、最低でも数マイクログラムの抗原を必要とするため、微量の蛋白質を抗原でもパンニングが可能であったメンブランパンニングの有用性が示唆された。

General に posthumous son 伝 を の function is す る の は, complex 雑 な modification after turn 訳 を 経 た end product で あ る protein で あ る た め, protein そ の も の を の analytical し, disease diagnosis や treatment に 応 with す の る antibody as a system of technology to establish が stay at さ れ て い る. Above の 観 point か ら, this study で は, "hundreds of か ら over thousands kinds も masato の disease even in a protein の か ら medical 薬 product シ ー ズ あ る い は gen 薬 タ ー ゲ ッ ト と な る protein を ground り 込 む た め の medical 薬 learn か つ 薬 clinical study base plate technology の 発" を purpose と し て, sickness, masato protein を know す る antibody を quickly か つ に as a snare It is possible that とする technology is developed を to った. そ こ で ま ず, あ ら ゆ る antigen に す seaborne る antibody を containing ん だ ナ イ ー ブ B cells レ セ プ タ ー posthumous son 伝 ラ イ ブ ラ リ を フ ァ ー ジ フ ァ ー ジ surface に prompt さ せ る こ と を purpose に, antigen で あ る VL と VH ド メ イ ン を リ ン カ ー match column で つ な ぎ close わ せ た antibody (scFV) a lock を フ ァ ー ジ に prompt さ せ Variable region gene った ら ロ ロ ニ ニ グする グする technology <s:1> develop を line った. そ の results, ナ イ ー ブ B cells レ セ プ タ ー posthumous son 伝 を PCR に て rights, picture back 収 し, ラ イ ブ ラ リ サ イ ズ が 2.4 * 10 ^ 9 の ラ イ ブ ラ リ サ イ ズ を hold つ antibody ラ イ ブ ラ リ の cropping に successful し た. Secondary に, extremely trace amounts of disease-related proteins に establish を lines った against するアフィニティパ ニ ニ グ グ technology <e:1>. Like disorders seaborne と し て は, milk が ん と breast に origin す る cell lines の 発 difference line analytical を い now, 2 d - DIGE を with い た タ ン パ ク の the separation お よ び 発 now line analytical を い, 発 now - see の ら れ る plural の タ ン パ ク qualitative ス ポ ッ ト を be す る こ と が た. さ ら に, タ ン パ ク を returned to 収 し, ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト な ど に domestic さ れ る ニ ト ロ セ ル ロ ー ス membrane に planning write し, パ ン ニ ン グ conditions の line optimization を っ た. そ の results, only 100 pg か と い う trace の antigen に し seaborne て も anti 応 sex を を must hold つ a lock antibody を る conditions established す る こ と が た. Usually, こ の ア フ ィ ニ テ ィ パ ン ニ ン グ の operation に は, イ ム ノ チ ュ ー ブ が with い ら れ る が, イ ム ノ チ ュ ー ブ へ の solid phase change に は, minimum で も number マ イ ク ロ グ ラ ム の antigen を necessary と す る た め, trace の を antigen protein で も パ ン ニ ン グ が may で あ っ た メ ン ブ ラ ン パ ン ニ ン グ の usefulness が in stopping さ れ た.

项目成果

Quality enhancement of the non-immune phage scFv library to isolate effective antibodies

• DOI: 10.1248/bpb.29.1325
• 发表时间: 2006-07-01
• 期刊: BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN
• 影响因子: 2
• 作者: Imai, Sunao;Mukai, Yohei;Tsunoda, Shin-ichi
• 通讯作者: Tsunoda, Shin-ichi

Optimization of anti-tumor necrosis factor-alpha single chain Fv displayed on phages for creation of functional antibodies.

优化噬菌体上展示的抗肿瘤坏死因子-α 单链 Fv，用于创建功能性抗体。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Pharmazie. 61・10
• 作者: Sato Y;Nakanuma Y et al.;Sato Y.et al.;Sato Y.et al.;Kamada H et al.;Fujii K et al.;Kawamura M et al.;Mukai Y et al.
• 通讯作者: Mukai Y et al.