神経活動依存的逆行性標識による性腺刺激ホルモン排卵性大量分泌中枢の特定

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性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは脳による生殖内分泌調節の最終共通路であり、上位の脳機構からの支配を受けて、下垂体前葉を調節し性腺からのホルモン分泌調節や配偶子の形成を行っている。上位の脳機構についてはほとんどわかっていない。γ-アミノ酪酸(GABA)A受容体(GABA_AR)を介するGABA、AMPA受容体を介するグルタミン酸、キスペプチンなどのペプチドがGnRHニューロンの活動を調節すると考えられている。本研究では当初、古典的経シナプス性制御に着目し、無毒化した破傷風毒素(TTC)が神経活動依存的に逆行性系シナプス性標識を行うという特徴を活用し、GnRHニューロンに投射しているニューロンをトランスジェニックラットで可視化することを試みた。GnRHプロモーターの下流に蛍光蛋白であるEGFPとTTC遺伝子をつなげた導入遺伝子を用い、4系統のトランスジェニックラットを得、サザンブロット法によりこれらのラットに遺伝子導入が起こっていることを確認し表現型を検討したが、何れの系統においても脳内GnRHニューロンあるいは他のニューロンにEGFP標識が見られなかった。性腺摘除を行ってフィードバック環を開放してGnRHニューロンの過剰な活動を起こしたり、経代を重ねることで目的の表現型が得られるかについても検討したが、計画年度内には成功に至らなかった。一方、蛍光タンパク遣伝子の導入により、可視化したラットGnRHニューロンを対象とする実験では、GnRHニューロンにGABA_ARのα2,β3,γ1またはγ2サブユニットが発現していることをRT-PCR法で確認し、グラミシジン穿孔パッチクランプ法により、GnRHニューロンでは細胞内塩素イオン濃度が高く、成熟後もGABA_ARの活性化が脱分極を起こすこと、低濃度のGABAは活動電位の発生を促すが、高濃度では脱分極ブロックにより、活動電位の発生を抑えることを見いだし報告した(Yin etal.,2008)。gabazineによるGABA_A電流の阻止効果が限定的であったこと、この実験における低濃度のGABAは前脳底部におけるシナプス外GABAの濃度に相当することの2点から、シナプス外のGABA_ARの活性化がGnRHニューロンの調節に大きな役割を果たしていることが示唆され、本実験計画の当初の仮説の妥当性を考え直す契機となった。以上、本研究計画は当初の成果を挙げられなかったが、GnRHニューロン、ひいては視床下部ペプチド作動性ニューロンの調節一般について、古典的考え方にとらわれない新規な発想を導くに至った点で、有益であった。