リコンビナントTLR融合蛋白を用いた病原体バイオセンサーの開発

利用重组TLR融合蛋白开发病原体生物传感器

• 批准号: 18659128
• 负责人: 鈴木 幸一
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: National Institute of Infectious Diseases
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659128/
• 关键词: TLR; 病原体; センサー; 分子間相互作用; 融合タンパク; QCM; SPR

環境中に存在する様々な病原微生物を迅速かつ高感度に検出する方法はなく、そのような手法の開発が望まれている。TLRのようなパターン認識受容体と病原体構成成分は無細胞系でも結合が起こることから、これをバイオセンサーとして利用する可能性に関する基礎研究を行った。非メチル化CpGモチーフを認識するヒトTLR9のリガンド結合部位であるleucin-rich repeatを含む細胞外ドメインと、免疫グロブリンFc部分とを融合させた蛋白を発現するようなプラスミドを構築した。作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションして大量調整し、これをHEK293細胞を用いた大量発現系で発現させ、TLR融合蛋白をプロテインGアフィニティー精製した。このTLR9融合蛋白とそれらに対応する既知のリガンドである非メチル化CpGオリゴDNAやTLR9刺激能を欠くコントロールDNAなどとの分子間相互作用を表面プラズモン共鳴(SPR)、および水晶発振子マイクロバランス(QCM)法の2種類の方法によって定量的に測定を試みた。その結果、SPRでは測定系が不安定であったが、QCMを用いることでCpG DNA特異的に分子間相互作用を高感度に検出可能であり、用いる塩基配列による親和性の差も検出できることが明らかとなった。一方で、TLR2融合蛋白も同様に作製し、リガンドであるpeptidoglycanとの結合を評価したが、満足できる特異性は得られなかった。本研究成果によって、将来的に複数のTLR融合蛋白を組み合わせて用いることで、様々な種類の病原体を検出するバイオセンサーが開発できる可能性が示唆された。

没有方法可以快速，敏感地检测到环境中存在的各种致病性微生物，并且需要这种方法的发展。由于诸如TLR和病原体成分​​之类的模式识别受体在无细胞系统中相互结合，因此对将其用作生物传感器的可能性进行了基础研究。构建了质粒以表达蛋白质，该蛋白质融合了包含富含白菜的重复的细胞外结构域，这是人类TLR9的配体结合位点，识别未甲基化的CpG基序和免疫球蛋白FC部分。将制备的质粒转化为大肠杆菌并在很大程度上调节，并在使用HEK293细胞的大规模表达系统中表达，TLR融合蛋白通过蛋白G亲和力纯化。我们试图定量测量该TLR9融合蛋白与它们相应的已知配体，未甲基化的CpG寡素体和对照DNA之间的分子间相互作用，该配体使用两种方法缺乏TLR9刺激能力：表面等离子体上的刺激能力：表面等离子体共振（SPR）和石英振荡器微生物（QCM）。结果，尽管测量系统在SPR中是不稳定的，但据显示，使用QCM可以高灵敏度检测专门针对CPG DNA的分子间相互作用，并且还可以根据所使用的基本序列检测到亲和力的差异。另一方面，类似地产生了TLR2融合蛋白，并评估了与配体辣椒聚糖的结合，但未获得令人满意的特异性。这项研究发现表明，将来可以通过组合多种TLR融合蛋白来开发可以检测到各种病原体的生物传感器。

项目成果

らい菌感染マクロファージ内における菌の寄生と排除に関わる分子機構の相互作用

麻风分枝杆菌感染的巨噬细胞内细菌寄生和清除相关分子机制的相互作用

• 发表时间: 2007
• 作者: Honma;S.;et al.;Kazutake Hirooka;Yasutaro Fujita;Kei Asai;Hiroshi Matsuoka;Mitsuo Ogura;Ken-ichi Yoshida;藤田泰太郎;松岡 浩史;東條 繁郎;Yasutaro Fujita(著・編);M. Hatakeyama;Kazuhiro Matsumoto;I. Tsuda;Y. Fukushima;伊藤孝男;Y.Yamaguti;K.Matsumoto;S.Tadokoro;津田一郎;津田一郎;S. Kuroda;H. Fujii;I. Tsuda;津田一郎;津田一郎;津田一郎;I. Tsuda;I. Tsuda;I. Tsuda;津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);佐藤譲(訳);Rocchi R;Yamazaki K;Sellitti D;Jounai N;石井 則久;Nakanaga K;Saha S;Takeshita F;Hasan UA;石井 則久;赤間 剛;永岡 譲;中永 和枝;Takeshita F;Hasan UA;Suzuki K;Suzuki K;Takeshita F;Suzuki K;Sasaki S;Saha S;Saha S;鈴木幸一;石井則久;鈴木幸一;鈴木幸一;石井則久;石井則久;石井則久;野口義彦;Huhehasi Wu;山崎 和子;谷川 和也;中永 和枝;谷川 和也
• 通讯作者: 谷川 和也

ハンセン病制圧後のハンセン病対策戦略。

根除麻风病后控制麻风病的策略。

• 发表时间: 2006
• 期刊: 日本ハンセン病学会誌 75
• 作者: Honma;S.;et al.;Kazutake Hirooka;Yasutaro Fujita;Kei Asai;Hiroshi Matsuoka;Mitsuo Ogura;Ken-ichi Yoshida;藤田泰太郎;松岡 浩史;東條 繁郎;Yasutaro Fujita(著・編);M. Hatakeyama;Kazuhiro Matsumoto;I. Tsuda;Y. Fukushima;伊藤孝男;Y.Yamaguti;K.Matsumoto;S.Tadokoro;津田一郎;津田一郎;S. Kuroda;H. Fujii;I. Tsuda;津田一郎;津田一郎;津田一郎;I. Tsuda;I. Tsuda;I. Tsuda;津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);佐藤譲(訳);Rocchi R;Yamazaki K;Sellitti D;Jounai N;石井 則久;Nakanaga K;Saha S;Takeshita F;Hasan UA;石井 則久;赤間 剛;永岡 譲;中永 和枝;Takeshita F;Hasan UA;Suzuki K;Suzuki K;Takeshita F;Suzuki K;Sasaki S;Saha S;Saha S;鈴木幸一;石井則久;鈴木幸一;鈴木幸一;石井則久;石井則久
• 通讯作者: 石井則久

非免疫担当細胞である甲状腺細胞が持つ自然免疫能と獲得免疫能の核酸成分による誘導

通过核酸成分诱导甲状腺细胞（非免疫活性细胞）的先天性和适应性免疫

• 发表时间: 2007
• 作者: Nagata N;Iwata N;Hasegawa H;Fukushi S;Yokoyama M;Harashima A;Sato Y;Saijo M;Morikawa S;Sata T;Saha S et al.;Saha S et al.;Sasaki S;Takeshita F et al.;Saha S et al.;Ishii KJ et al.;Rocchi R;Yamazaki K;Sellitti D;Jounai N;石井 則久;Nakanaga K;Takeshita F;Hasan UA;石井 則久;赤間 剛;永岡 譲;中永 和枝;Takeshita F;Hasan UA;Saha S;Suzuki K;Suzuki K;Takeshita F;Suzuki K;Sasaki S;Saha S;Saha S;鈴木幸一;石井則久;鈴木幸一;鈴木幸一;石井則久;石井則久;石井則久;野口 義彦;Huhehasi Wu;山崎 和子;谷川 和也;中永 和枝;谷川 和也;山崎 和子;鈴木 幸一
• 通讯作者: 鈴木 幸一

Pendred症候群。

彭德雷德综合症。

• 发表时间: 2006
• 期刊: 日本臨床、別冊、内分泌症候群 1
• 作者: Honma;S.;et al.;Kazutake Hirooka;Yasutaro Fujita;Kei Asai;Hiroshi Matsuoka;Mitsuo Ogura;Ken-ichi Yoshida;藤田泰太郎;松岡 浩史;東條 繁郎;Yasutaro Fujita(著・編);M. Hatakeyama;Kazuhiro Matsumoto;I. Tsuda;Y. Fukushima;伊藤孝男;Y.Yamaguti;K.Matsumoto;S.Tadokoro;津田一郎;津田一郎;S. Kuroda;H. Fujii;I. Tsuda;津田一郎;津田一郎;津田一郎;I. Tsuda;I. Tsuda;I. Tsuda;津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);佐藤譲(訳);Rocchi R;Yamazaki K;Sellitti D;Jounai N;石井 則久;Nakanaga K;Saha S;Takeshita F;Hasan UA;石井 則久;赤間 剛;永岡 譲;中永 和枝;Takeshita F;Hasan UA;Suzuki K;Suzuki K;Takeshita F;Suzuki K;Sasaki S;Saha S;Saha S;鈴木幸一;石井則久;鈴木幸一
• 通讯作者: 鈴木幸一

新規サイログロブリン遺伝子バリアントのクローニング

新型甲状腺球蛋白基因变体的克隆

• 发表时间: 2008
• 作者: Honma;S.;et al.;Kazutake Hirooka;Yasutaro Fujita;Kei Asai;Hiroshi Matsuoka;Mitsuo Ogura;Ken-ichi Yoshida;藤田泰太郎;松岡 浩史;東條 繁郎;Yasutaro Fujita(著・編);M. Hatakeyama;Kazuhiro Matsumoto;I. Tsuda;Y. Fukushima;伊藤孝男;Y.Yamaguti;K.Matsumoto;S.Tadokoro;津田一郎;津田一郎;S. Kuroda;H. Fujii;I. Tsuda;津田一郎;津田一郎;津田一郎;I. Tsuda;I. Tsuda;I. Tsuda;津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);津田一郎(監訳);佐藤譲(訳);Rocchi R;Yamazaki K;Sellitti D;Jounai N;石井 則久;Nakanaga K;Saha S;Takeshita F;Hasan UA;石井 則久;赤間 剛;永岡 譲;中永 和枝;Takeshita F;Hasan UA;Suzuki K;Suzuki K;Takeshita F;Suzuki K;Sasaki S;Saha S;Saha S;鈴木幸一;石井則久;鈴木幸一;鈴木幸一;石井則久;石井則久;石井則久;野口義彦;Huhehasi Wu
• 通讯作者: Huhehasi Wu